Nature：拟南芥微生物组功能研究1培养组学—高通量细菌分离培养鉴定

背景介绍

Bai, Y., et al. (2015). “Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota.” Nature 528(7582): 364-369.

本文是2015末发表在Nature的Article文章，第一作者为白洋，主要负责拟南芥根相关菌分离、培养、测序和人工重组实验，现中科院遗传发育所研究员；共一的第四作者Ruben Garrido-Oter，主要负责细菌鉴定、基因组和扩增子分析，现马普植物育种所Group Leader。通讯作者分别为德国马普植物育种所的Paul Schulze-Lefert教授和瑞士苏黎士微生物所的Julia A. Vorholt教授。

由于本文内容极多，分为四篇文章进行介绍：
- 0概述
- 1细菌分离培养鉴定
- 2细菌基因组测序和分析
- 3人工重组微生物群落

本文是此系列的第二篇：1细菌分离培养鉴定。

土壤中微生物如何分离培养

土壤细菌分离培养方法(图片来自白洋组主页 bailab.genetics.ac.cn )
主要分别两类方法：平板划线法，梯度稀释法；本研究两者方法均使用，第一作者白洋主要通过梯度稀释法分离根部菌，而来自瑞士的共同一作Daniel B. Müller2主要通过平板划线法分离叶片菌，且都获得了过成千上万个单克降，用于下一步鉴定。
详细方法见文章原文。

大规模分离的菌如何鉴定

Supplementary Figure 1 | 高通量条码(barcode)系统鉴定分离细菌16S V5-V8区。本方法基于Goodman et al., 2011的两步条码法，并优化PCR扩增799F到1392R部分的接头序列。第一轮的PCR添加的条码，用于区分来自96b孔板中孔的位置；第二轮添加的条码，用于区分不同的PCR板。这样组合所有带有标签的PCR产物，并用罗氏454测序仪产生数据。

你可以采用挑单克隆Sanger法测序，但对于上万个菌斑的测序和鉴定，时间、成本和效果都值得考虑。本文采用454加双重barcode的方法高通量测序，这是几年前的方法。目前比较适合用HiSeq或MiSeq来测序鉴定，只要460bp以内(40bp用于双端匹配和双barcode)的片段都可以。举个例子，第一个barcode 96个，用于识别96孔板只的每个孔，第二个barcode同样96个用于区分96个不同的板；建成一个文库，测序5G数据，平均每个单菌的测序数据大于1000条，可以很容易的统计分析目标是否是单菌，单菌为何种菌；如果是多菌，是那几种菌的混合，主要是什么菌等信息。非常高效，成本也极低，信息更全面。

土壤中到底多少菌可以培养

之前的文章一直报导，只有1%的微生物可以培养。其实这只是很多年前的估计值，而且那个年代也没有宏基因组技术，完全没有大规模实验数据作为根据，大家却互相不断引用。

本研究采用四种培养基，对土壤中的细菌进行大量的分离和培养。对于根际中丰度最高的前一百种OTU，分离培养了64%，即使在其它相关研究的数据中，同样可培养物种50%以上。

Extended Data Figure 1 | 16S扩增子分析自然拟南芥根际细菌，并标示可培养的比例。图中只展示丰度前一百的OTU。
a，本研究根前100中64%分离到了单菌；b, 分离菌在Bulgarelli et al., 2012发表数据中比例；c, 分离菌在Schlaeppi et al., 2014年发表数据中比例；d, 叶片中分离培养菌比例。外环的黑色正方形代表这类OTU中存在相似菌被分离培养。

不同地点叶际细菌群体比较

Extended Data Figure 2 | 基于16S扩增子分析不同地区的拟南芥叶际细菌群体Beta多样性。共有60个样品, a,b,c,d分别采用四种不同的距离矩阵；四层标签分别代表地区，不同种植类型，季节，取样方式。

结果表明：无论是单株、还是混样，还有不同地区和取样地点的叶际微生物群落结果相似度很更，有很好的一致性。

土壤、根际和叶际中分离培养的菌

Extended Data Figure 3 | 采用物种树展示根际(a, 206个单菌) 叶际(b, 224个单菌) 土壤 (c, 33个单菌)中分离培养的菌； 图中圈中的数字代表97%相似的菌，但来自不同批次。

展示从三种不同Compartment分离的菌，在门、纲、目、科、属水平上主要的分类单元，其中按科水平标注了名称，并按门和纲水平上色。

根际和叶际菌种类比较

Extended Data Figure 4 比较在自然土中种植拟南芥根、叶相关菌群的物种分类情况。 a/c分别为属和OTU水平；a/b分别为根或叶中丰度最高的20类Taxonomy相对丰度；可以看到根、叶中高丰度菌很多是一致的。