【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞迁移（细胞划痕实验 + transwell实验）

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1. 细胞迁移

• 细胞迁移 （cell migration）：是多细胞生物发育和存活关键的生物学过程，是细胞运动的表型之一。胚胎发育时器官的形成、伤口的愈合、免疫应答等都需要细胞非常精准的迁移到特定部位。当有外部信号（化学、机械信号）刺激时，也会引起细胞发生迁移。

• 细胞迁移的机制：
  ① 有的细胞有鞭毛或纤毛，通过鞭毛或纤毛摆动就能运动，如精子；
  ② 通过细胞的变形，带动细胞的移动，如肌动蛋白 Actin 的聚合状态发生改变带动细胞变形。
  △Actin 是细胞骨架的组分之一，Actin 的聚合能使细胞形成突出的角，Actin 在这个角不断加聚，就能不断伸出，随后细胞边缘也发生相应变化，从而带着细胞移动。用带荧光标记的鬼笔环肽染 Actin，看 Actin 的排列是否改变，没有运动起来的细胞，Actin 排列是规整的，运动的细胞 Actin 排列就会变得紊乱，能看到延伸出来的角，细胞极性也发生改变。此外，还可以检测促进 Actin 聚合的分子的表达，如 Arp2/3 复合物、mDia1、mDia2。
  ③ 细胞膜流动：细胞运动时，细胞膜是循环流动的，外面的细胞膜与细胞内的细胞膜库发生交换，导致细胞迁移。
  ④ 细胞移动时还会涉及细胞核的重定位、高尔基体的重定向、微管组织中心的重定向。

• 细胞迁移能力：
  

• 细胞和细胞之间有细胞连接，细胞要能运动，就要先从原位置脱落下来，细胞粘附能力发生改变（粘附实验，检测细胞与细胞连接、细胞与基质连接的相关蛋白的表达，如整合素蛋白；效应器蛋白的表达，如 Rho GTP 酶；细胞粘附相关的信号通路分子如 FAK、Src、Paxillin、Crk、PAK、GIT；能破坏粘附复合物的蛋白酶的表达）；

• 体外培养细胞是让细胞在一个支持物上，细胞在培养皿表面长成单层细胞（2D），检测单层细胞的运动可以用 划痕实验 检测细胞是否具有运动能力。

• 体内细胞是处于 3D 环境，细胞可以从一个平面爬到另一个平面，用 transwell实验。体内细胞还被细胞外基质包裹，细胞要运动就要能穿过细胞基质，用 matrigel 的 transwell 实验来观察细胞的运动能力（侵袭能力）。

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2. 检测细胞迁移：细胞划痕实验

划痕实验检测细胞迁移的原理

• 细胞划痕实验（Scratch assay or wound-healing assay）：
  先让细胞长满单层，细胞之间没有空隙，没有足够的空间可以移动；然后刮除一些细胞（造成“伤痕”），留出一些空间，如果细胞能迅速往这些空着的地方爬，说明细胞有迁移能力。
• 为了保证细胞是自己爬过去而不是因为细胞增殖被挤过去的，就需要用丝裂霉素处理，让细胞停止增殖；或者划出划痕后，把培养基换成无血清的培养基（有的细胞对无血清不耐受，可以少加点血清，维持细胞的状态） ，细胞在无血清的环境中生长极其缓慢，可以认为细胞不增殖。
• 细胞划痕实验是检测细胞在 2D 空间的迁移。
  

划痕实验检测细胞迁移的操作流程

• 适用于检测培养的细胞（贴壁细胞），不适用于检测组织样本

1. 标记 6 孔板：使用 marker 笔在 6 孔板的外底面画平行线。平行线间距约 0.5cm，线画直一点，为了保证后续拍照位置是相同的。
2. 制备细胞悬液：胰酶消化细胞，制备细胞悬液。
3. 铺 6 孔板：细胞计数后铺板，保证每组细胞铺板密度一致，且密度控制在第二天长满单层（提前摸索）。若过夜后细胞未完全长满，也可以适当延长培养时间，但如果细胞密度已经很大，尽量重新铺板，因为可能过一天后细胞太满，会导致细胞状态逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。
4. 制造划痕 ：用直尺比着，使用 10ul 枪制造细胞划痕（枪尖的平面垂直紧贴着培养板平面划过细胞层，最好保持力度一致，尽量一次性划完，保证每个划痕的宽度一样） ，划痕方向与标记线垂直。
   
5. 划痕后用显微镜照相，作为 0h 对照。保存图片为 TIF 格式。
6. 洗：吸去培养基，PBS 轻柔洗 3 次，充分洗去漂浮细胞。PBS 清洗时动作轻柔，贴壁缓慢加入，不要把贴壁细胞洗掉。
7. 换液：换无血清培养基，或低血清培养基（FBS≤2%），将细胞放入 37°C、5% CO₂ 培养箱培养。
8. 定时拍照或实时监测：选择合适时间点拍照，如 0h，6h，12h，24h 后取出细胞于显微镜下拍照。一般认为 24h 为细胞的一个周期，所以检测时间最好不要超过一个周期的时间。每次拍照前都用 PBS 洗 3 次，充分洗去漂浮细胞。
   ◆ 以预先做好的标记为定点观测点来进行定时拍照&#