3+肿瘤+预后模型+甲基化

今天给同学们分享一篇3+肿瘤+预后模型+甲基化的生信文章“Genomic and immunogenomic analysis of three prognostic signature genes in LUAD”，这篇文章于2023年1月17日发表在BMC Bioinformatics 期刊上，影响因子为3。

寻找与免疫治疗相关的标记物是筛选适合免疫治疗的目标人群的重要研究内容。早期肺癌的预后相关基因也可能影响肿瘤免疫微环境，进而影响免疫疗法。

图1 流程图

1.ImTRDG 的特征和功能富集结果

CTR-DB数据库中的两个数据集GSE135222和GSE126044是关于接受免疫化疗的NSCLC患者，共43例。根据免疫治疗的效果，他们被分为 13 例应答者（CR 和 PR）和 30 例非应答者（SD 和 PD）。通过差异分析和设定阈值，共筛选出 176 个差异基因，其中 72 个为上调基因，104 个为下调基因。图 2A 和 B 显示了差异基因的火山图和热图。

图2 差异分析

通过元图谱富集分析，提取了前 20 个显著结果，表明大部分差异基因参与了免疫相关通路（图 3A。通过 MOCODE 算法，作者得到了三个连接紧密的 PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）MCODE 成分，它们分别参与了中性粒细胞脱颗粒、自然杀伤细胞介导的细胞毒性调控和 CD8 TCR（T 细胞受体）通路。

图3 imTRDG 功能富集结果的可视化展示

2. 用于模型筛选和免疫浸润分析的目标基因

得到176个ImTRDGs后，进行单变量cox回归分析，共得到4个与T1N0M0 LUAD预后相关的基因（CLEC4E、HOXC8、MMP12和NFE2），如图4A-D所示。图 4A-D 根据基因表达量的中位值将样本分为高表达组和低表达组，并通过多重假设检验校正单变量 cox 回归分析的 P 值（得出 CLEC4E、HOXC8、MMP12 和 NFE2 的预后基因集）。通过多变量 cox 和阶跃函数，风险模型（Riskscore = -1.0068*NFE2 + 0.2741*MMP12 + 0.5986*HOXC8），根据风险评分的中位值将 81 例样本分为高危组和低危组，生存分析表明，高危组和低危组的生存率差异有统计学意义（HR = 3.491，95%CI：1.062-11.475，P = 0.0395）。1年、3年和5年的ROC曲线面积分别为0.916、0.90和86.3（图5A-C）。GSE50081、GSE11969和GSE42127数据被用来验证模型的准确性。结果显示，高危组和低危组患者的生存预后有统计学差异（分别为 p = 0.048、p = 0.033 和 p = 0.044）（图 6A-C），3 年 ROC 曲线面积分别为 0.64、0.76 和 0.88（图 6D-F），相对稳定。结合临床数据（年龄、性别和吸烟情况），进行单变量和多变量cox回归分析，结果显示MMP12、NFE2和HOXC8可作为T1N0M0 LUAD的独立预后因素。风险评分与免疫浸润评分之间的相关性分析表明，风险评分与细胞毒性、NK.细胞和 CD8T 细胞评分之间存在良好的正相关性（图 6G）。

图4 目标基因的单变量 K-M 生存曲线

图5 多变量 K-M 生存曲线和风险模型的 ROC 曲线

图6 

3.差异表达和多类型预后分析

从GTEx数据库中分析了这三个基因在LUAD和正常样本中的差异表达，结果显示MMP12和HOXC8在LUAD样本中高表达，而NFE2在LUAD样本中低表达（图2A，C）。用HPA检索了NFE2在LUAD和正常样本中的免疫组化信息，使用HPA001914抗体标记，结果显示NFE2在正常肺泡组织中中度染色，而在LUAD中低度染色。用HPA028911抗体标记正常肺泡组织，发现HOXC8未被染色，但在肺泡巨噬细胞中被中度染色，HOXC8在LUAD肿瘤组织中被中度染色。免疫组化和 mRNA 表达结果一致。(图 7A-D）生存分析表明，HOXC8 高表达与 LUAD 的不良 OS、PFS、DSS 和 DF 显著相关（图 8A-D）。

图7

图8 LUAD 中靶基因的多类型 K-M 生存曲线

4.基因表达和通路富集分析

GSCA-表达和通路活性模块估算了通路活性组（激活和抑制）之间三个基因的表达差异。结果表明，NFE2 对 LUAD 的凋亡、细胞周期、EMT 和激素 AR 通路有抑制作用，而对 MAPK 和 mTOR 通路有激活作用。MMP12 对 LUAD 的细胞凋亡、细胞周期和 EMT 通路有激活作用，对 MAPK 通路有抑制作用，而 HOXC8 对细胞周期通路有激活作用（图 9A）。通过通路 ssGSEA 分析，计算了目标基因与通路得分之间的关系，发现 MMP12 与细胞对缺氧的反应、肿瘤增殖特征、G2M_检查点、肿瘤炎症特征和 DNA 修复呈正相关。NFE2 与肿瘤增殖特征和 G2M_checkpoint 负相关，而 HOXC8 与肿瘤增殖特征和 G2M_checkpoint 正相关（图 9B）。

图9 目标基因与免疫浸润之间的相关性热图

5.目标基因的拷贝数变异 (CNV) 和甲基化生存预后分析

CNV和LUAD生存预后分析结果显示，与WT组相比，HOXC8和NFE2 CNV组与不良OS相关（图10A，B），NFE2 CNV组与LUAD不良PFS相关（图10C）。MMP12 CNV与DFI差相关（图10D）。整合三个基因后的 CNV 和生存预后分析结果显示，基因组 CNV 与 LUAD 的不良 OS 相关（图 10E）。生存期分析表明，MMP12 高甲基化水平与良好的 DFS、DSS 和 DFI 相关（图 10F-H）。

图10

6.药物敏感性分析

从 GDSC 数据库中，作者分析发现 NFE2 mRNA 表达与尼罗替尼、TL-1-85 和 BHG712 的 IC50 相关，MMP12 mRNA 表达与吉非替尼 IC50 负相关（图 11A），但未发现与 HOXC8 相关的敏感药物；CTRP 数据库分析发现 NFE2 mRNA 表达与 BRD-712 负相关。CTRP数据库分析发现，NFE2 mRNA表达与BRD-K01737880 IC50呈负相关，HOXC8 mRNA表达与tacedinaline、JQ-1 IC50呈正相关（图 11A），但没有发现与HOXC8相关的敏感药物；CTRP数据库分析发现，NFE2 mRNA表达与BRD-K01737880 IC50呈负相关，HOXC8 mRNA表达与tacedinaline、JQ-1 IC50呈正相关（图 11B）。在 MMP12 mRNA 高表达组和低表达组中，c-MET 靶向药物 PF2341066、ALK 靶向药物 TAE684 和 IGF1R 靶向药物 AEW541 的 IC50 差异均有统计学意义。

图11 不同药物的 IC50 在靶基因高表达组和低表达组之间的分布

7.免疫浸润分析

基因表达和免疫浸润分析表明，MMP12 与许多免疫浸润成分相关，其中与 nTreg、iTreg 和 Exhausted 呈正相关，与 Th17 和 Th2 呈负相关。NFE2 的表达与中央记忆负相关，HOXC8 的表达与 nTreg 正相关，与 Gamma_delta 和 MAIT（粘膜相关不变 T）负相关（图 12A）。

图12 目标基因与免疫浸润相关性的气泡图

基因 CNV 和免疫浸润结果显示，NFE2 和 HOXC8 CNV 与 nTreg 呈正相关，而与 CD4_T 和 Th2 呈负相关（图 12B）。基因甲基化和免疫浸润分析结果显示，MMP12甲基化与nTreg细胞呈负相关，与CD4 T细胞呈正相关；NFE2甲基化与Th17呈正相关，与NK细胞、Th1细胞、细胞毒性细胞和衰竭细胞呈负相关；HOXC8甲基化与DC呈正相关。在整合了三个基因的 CNV 结果后，分析了它们与免疫浸润的关系，发现在高 CNV 肿瘤中聚集了 nTreg、exhaust、effector_memory、单核细胞、中性粒细胞、Th1 细胞，而在低 CNV 肿瘤中聚集了 CD4 naive、Th2、Tfh、NKT（自然杀伤 T 细胞）、Gamma_delta、NK、MAIT 和 CD4 T（图 12D）。

8.目标基因与免疫检查点基因之间的表达关系和网络

对这三个基因与免疫检查点基因的相关性分析发现，只有 MMP12 与免疫检查点基因呈弱线性相关（图 13A）。根据目标基因的表达水平将其分为高表达组和低表达组。在 HOXC8 的高表达组和低表达组之间，CD274 和 HAVCR2 的表达有显著差异（图 13B）。在 NFE2 高表达组和低表达组中，HAVCR2、PDCD1LG2、CTLA4、TIGIT、LAG3 和 PDCD1 的表达均不同（图 13C）。在 MMP12 高表达组和低表达组中，SIGLEC15、TIGIT、CD274、HAVCR2、PDCD1、CTLA4、LAG3 和 PDCD1LG2 的表达均有统计学差异（图 13D）。通过GenCLiP 3网站分析风险靶基因和免疫校验基因的潜在调控网络，部分已被实验证实，部分调控网络仍需在实验区验证，如图14所示。

图13 目标基因与免疫检查点相关基因之间的相关性热图

图14 靶基因和免疫检查点相关基因的调控网络

9.目标基因和免疫应答

使用 TIDE 算法计算了三种靶基因的高表达和低表达 LUAD 对免疫疗法的反应结果显示，NFE2高表达组110例患者对免疫治疗有反应，147例患者对免疫治疗无反应，NFE2低表达组87例患者对免疫治疗有反应，169例患者对免疫治疗无反应。TIDE 评分结果显示，NFE2 低表达组的 TIDE 评分较高，表明免疫治疗效果不佳，说明 NFE2 的高表达可能是免疫治疗的阳性指标（图 15A）。这与 CTR-DB 免疫治疗反应差异基因结果一致（图 15B）。

图15 不同靶基因表达情况下的免疫治疗效果预测

在HOXC8高表达组中，85名患者对免疫治疗有反应，172名患者对免疫治疗无反应；在HOXC8低表达组中，112名患者对免疫治疗有反应，144名患者对免疫治疗无反应。TIDE评分结果显示，HOXC8高表达组的TIDE评分较高，说明免疫治疗效果较差，这意味着HOXC8的高表达可能是免疫治疗的一个负面指标（图15C），这与CTR-DB免疫治疗反应差异基因结果一致（图15D）。在MMP12高表达组中，119名患者对免疫治疗有反应，137名患者对免疫治疗无反应；在MMP12低表达组中，78名患者对免疫治疗有反应，179名患者对免疫治疗无反应。TIDE评分结果显示，MMP12低表达组的TIDE评分较高，表明免疫治疗效果不佳，说明MMP12的高表达可能是免疫治疗的一个阳性指标（图15E）。这与 CTR-DB 免疫治疗反应差异基因结果一致（图 15F）。

总结

总之，作者的生物信息学研究结果表明，MMP12、NFE2和HOXC8构建的LUAD早期预后模型具有较好的预测价值；MMP12、NFE2和HOXC8在不同程度上参与了LUAD的形成和生长途径，可能会影响一些抗肿瘤药物的疗效；MMP12、NFE2、HOXC8的mRNA表达、甲基化水平和CNV状态与某些免疫浸润成分有一定的线性关系，可能参与肿瘤的免疫调节；MMP12、NFE2、HOXC8和免疫检查点相关基因具有复杂的调控网络，影响免疫治疗，有望成为免疫治疗的标志物，值得进一步实验研究。本研究不可避免地存在一些局限性。首先，作者利用生物信息学方法初步探索了三个靶基因可能参与的免疫调节功能，并预测了NSCLC免疫治疗的效果，生物信息学分析仍缺乏较强的说服力，需要后续实验验证。同时，由于最初纳入的免疫治疗样本没有长期生存数据，因此无法证明靶基因对 NSCLC 免疫治疗长期生存的预测价值。