单细胞上游分析

本文最后修改时间为2024/3/27

1 安装Linux系统

硬件信息

组件	具体硬件
CPU	13700KF 16C24T
主板	ROG STRIX Z690-A GAMING WIFI
运行内存	英睿达 32GB*4 DDR5 4800Hz
GPU	Nvidia 4090 24G
磁盘驱动器（作为Ubuntu系统盘）	西数 SN580 2TB

注：这台电脑之前已有安装Windows11专业版，对应的存储盘的参数在此省略

制作系统盘

64G的格式化后的空U盘，Ubuntu22.04.4，清华镜像也可以下载。从UltraISO软碟通中文官方网站 - 光盘映像文件制作/编辑/转换工具下载UltraISO试用版制作系统盘。

具体过程参考Windows+Ubuntu20.04双系统安装教程 - 知乎 (zhihu.com)

相信能看到这篇文章的人至少对英文操作系统不至于抓瞎，所以我推荐直接英文完成安装。一开始就改语言会把系统的真实路径一起给改了，可能会出奇怪的bug，装完后可以调语言的。

参考里创建分区有点问题：

1. swap交换分区（虚拟内存），逻辑分区，我分了32GB，只要不超内存这个设置没问题
2. boot分区 ，逻辑分区，默认ext4。 300M不够的，我装完后直接满了，然后总是弹窗提示我扩容，非常烦人，我索性改成2G了
3. root分区，逻辑分区，我给了250G就可以，默认ext4，
4. home分区，主分区，默认ext4，剩下的全部分给它了，1.6TB左右，用户的所有文件都在这里。

磁盘重新划分

如果你和我一样碰到了存储分配不当的问题，不拔U盘，继续走UEFI启动，在图形化界面那一步直接选择试用Ubuntu，可以参考Ubuntu扩展所有分区空间的完整教程_ubuntu扩展分区空间-CSDN博客

常用软件

1. Edge：我本人不太喜欢火狐和Chrome，下载常用软件，可以登文件传输助手

2. 百度网盘：备份和互传文件用，缺点是网速十分感人，500M宽带下传1G文件都很痛苦。据说可以用SSH传文件，等有空再研究研究。

2 安装conda环境

Linux安装conda - 知乎 (zhihu.com)

熟悉windows下anaconda环境的朋友这一步应该是轻车熟路，按着教程做就完了，不作赘述，参考的这篇文章也是做上游的，本文要用到的包括sratoolkit、aspera、parrallel-fastq-dump

3 需要用到的一些Linux基础操作

常见命令

会用cd，ls就差不多了，其他的命令我也记不住，现用现查吧

新手慎用rm，在图形界面下手动删除

Ubuntu 20.04 LTS 系统自带的截图功能 - 肥斯大只仔 - 博客园 (cnblogs.com)

bash脚本和vim

vim操作在添加路径的时候要用到，简单的几个命令要记一下：Linux 之 Vim 命令使用（详细总结） - 知乎 (zhihu.com)

bash脚本和bat脚本就是换汤不换药，想提高效率可以读一下鸟叔的那本书，讲的很到位

4 下载sra数据

曾健明大佬的上游流程有点老了，可以参考着做，但是有很多坑：单细胞实战(一)数据下载 (qq.com)，他写的脚本对于较小的下载没有问题，但是对于我这个样本就有点离谱了

我是走ENA Browser下的lite文件，关于lite文件和sra文件的区别可以参考NCBI的SRA Lite和SRA Normalized数据有什么区别 - 组学大讲堂问答社区 (omicsclass.com)

workd="/home/williamhan/bioproject/MCAO20240324"

cd $workd/raw

# aspera密钥路径

openssh="/home/williamhan/miniconda3/envs/transcriptomics/etc/asperaweb_id_dsa.openssh"

# 参照https://zhuanlan.zhihu.com/p/667695791下载整理下file.lst, 名字不变

ascp -vQT -l 500m -P33001 -k 1 -i $openssh\

 --host fasp.sra.ebi.ac.uk\

 --user era-fasp\

 --file-list file_sra.lst\

 --mode recv\

 ./

-v verbose mode 唠叨模式，能让你实时知道程序在干啥，方便查错。有些作者的程序缺乏人性化，运行之后，只见光标闪，压根不知道运行到哪了

-T 取消加密，否则有时候数据下载不了

-i 提供私钥文件的地址，地址一般是~/miniconda3/etc/asperaweb_id_dsa.openssh

-l 设置最大传输速度，一般200m到500m，如果不设置，反而速度会比较低，可能有个较低的默认值，不知道网速的上中国科学技术大学测速网站 (ustc.edu.cn)测一下看看

-k 断点续传，一般设置为值1

-Q 加入队列

-P 提供SSH port，一般是33001

然后用parallel-fastq-dump基于lite文件把fastq.gz文件下载下来，关于我为啥不用曾老师教程里推荐的fastq-dump和官方推荐的fasterq-dump，可参见以下三个网址：

sratoolkit官方Github介绍：08. prefetch and fasterq dump · ncbi/sra-tools Wiki (github.com)

parallel-fastq-dump的Github页面：rvalieris/parallel-fastq-dump: parallel fastq-dump wrapper (github.com)

速度比较：fastq-dump、fasterq-dump和parallel-fastq-dump处理SRA文件的速度比较 - 简书 (jianshu.com)

workd="/home/williamhan/bioproject/MCAO20240324"
cd $workd/raw

cat SRR_Acc_List.txt |while read i
do
	parallel-fastq-dump -t 12  -O ./${i} --split-files --gzip -s ${i}.lite
done

-t 代表线程数

-O 代表输出路径

--split-files 代表拆分文件，一定要加！原因详见单细胞实战(二) cell ranger使用前注意事项 (qq.com)

--gzip 压缩为.gz格式，这个一定要点，拿上面图中57.7Gb的文件为例，下载下来未经压缩的fastq文件加起来有250多G！

-s sra或lite文件地址

按照曾老师的教程，下载下来应该是3个文件，但是我始终是两个文件。我推测这个样本只上传了read文件。改名之后，只有R1和R2一样可以跑

# 比如，将原来的SRR7692286_1.fastq.gz改成SRR7692286_S1_L001_I1_001.fastq.gz
# 依次类推，将原来_2的改成R1，将_3改成R2
# 但是有些文件只有两个的，说明不包含Index文件
# 改名方法是_1改为R1,_2改为R2
fq_dir=/home/williamhan/bioproject/MCAO20240324/raw
cd $fq_dir

cat $fq_dir/SRR_Acc_List.txt |while read i
do 
	# 三个文件改名
	# mv ${i}_1*.gz ${i}_S1_L001_I1_001.fastq.gz;
	# mv ${i}_2*.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;
	# mv ${i}_3*.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz;
	# 两个文件改名：
	mv ${i}/${i}.lite_1.fastq.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;
	mv ${i}/${i}.lite_2.fastq.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz;
done

5 cell ranger下载和运行

下载

参考链接：

Installing Cell Ranger - Official 10x Genomics Support

10X单细胞测序分析软件Cell Ranger安装笔记 - 知乎 (zhihu.com)

官方下载链接：Download Cell Ranger - Official 10x Genomics Support

需要你填一下个人信息，填完就可以下载。

这三步是必须要做的

转录本我懒得从ENTREZ那里找了，直接从10x给的链接下了

我装的版本的8.0.0，我和上面唯一的区别是我直接把cell ranger的路径添加为所有用户的全局变量了

sudo vim /etc/profile

运行

# cellranger定量
echo $(date "+%Y-%m-%d %H:%M:%S")
db=/home/williamhan/opt/refdata-gex-GRCh38_and_GRCm39-2024-A
ls $db

fq_dir=/home/williamhan/bioproject/MCAO20240324/raw

cat $fq_dir/SRR_Acc_List_PRJNA912889.txt |while read i
do cellranger count --id=$i --localcores=21 --create-bam false \
--transcriptome=$db --fastqs=${fq_dir}/${i} --sample=$i --nosecondary --expect-cells=10000
done

--id 文件地址

--localcores 线程数

--create-bam 是否输出bam文件

--transcriptome 转录本数据库，直接从官网下载就完了

12:40开始运行, 14:58结束


运行负载（设置的32G swap根本用不上）

结果分析

其他的文件都不重要，结果文件夹里out文件夹的内容是我们需要的

最下面那个html是对流程的概述，可以看一眼。

我们下游分析文件在filtered_feature_bc_matrix文件夹里

下游降维聚类结果：