游离胎儿DNA检测（NIPT）及其与产前指标的相关性

1. 背景知识

游离胎儿 DNA（cffDNA）产前检测，又称无创产前检测（NIPT），因其高灵敏度和特异性，成为血清学筛查和侵入性检测的有吸引力的替代方法。

目前，NIPT 主要用于筛查 21 三体、18 三体和 13 三体等高危妊娠。然而，由于血浆中的 cffDNA 主要来源于胎盘滋养层细胞，其检测结果可能与超声检查和 / 或胎儿实际染色体组成不一致。

此外，许多因素可能导致 NIPT 检测出现假阳性，包括母体染色体异常、母体肿瘤（霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等）、消失的双胎、胎盘局限性胎盘嵌合体（CPM），甚至胎盘嵌合现象。到目前为止，NIPT 一直被用作筛查方法，而不是诊断测试；它不能取代绒毛膜绒毛取样和羊膜穿刺术等侵入性诊断方法。

目前应用最广泛的两种 NIPT 方法是单核苷酸多态性（SNP）检测法和全基因组测序（WGS）法。这两种方法在检测常见非整倍体（T21、T18、T13 和 X 单体）方面具有相当的临床灵敏度。在本研究中，通过分析来自中国中部地区孕妇的 14316 份血浆 cffDNA WGS 筛查数据，探讨 NIPT 筛查作为一种有用的产前筛查工具，在实现高质量孕期护理方面的临床意义。论文作者研究了 NIPT 与产前检测指征的相关性，特别是其在检测 21 三体、18 三体、13 三体、性染色体非整倍体（SCA）、非 21/18/13 常染色体非整倍体和 CNV 异常方面的灵敏度和特异性。我们还分析了 NIPT 结果出现假阳性和假阴性的可能原因。

2. 方法

数据来源：2013 年 10 月至 2018 年 11 月，武汉大学人民医院共纳入 14316 名孕妇。

对 14316 名有产前检测指征的孕妇进行回顾性分析，这些指征包括高龄产妇（≥35 岁）、母体血清筛查异常、颈项透明层增厚（≥2.5mm）、其他超声异常、双胎妊娠 / 体外受精 - 胚胎移植（IVF - ET）妊娠等。本研究采用母体血浆 cffDNA 全基因组测序（WGS）技术。

2.1 cffDNA 的制备和测序

采集 5ml 母体外周血于 EDTA 管中，充分混匀后暂时储存在 4°C 冰箱中。若发生溶血或在血浆分离前样本储存超过 8 小时，则排除该样本。通过在 4°C、1600×g 条件下离心血液样本 10 分钟，分离血浆并分装至 2.0mL Eppendorf 管中。所得血浆在 4°C、16000×g 条件下再次离心 10 分钟。小心地将上清液以 600μL 每份分装到新的 2.0mL Eppendorf 管中，并储存在 - 80°C 用于 cffDNA 提取。使用 NucleoMag cfDNA 分离试剂盒（中国北京 Takara 公司）按照制造商的说明书进行血浆 cffDNA 提取。使用胎儿染色体非整倍体（T21、T18 和 T13）检测试剂盒（中国北京博奥生物有限公司）进行文库构建、质量控制和文库扩增。按照制造商的说明，使用 BioelectronSeq 4000 半导体测序系统（中国北京博奥生物有限公司）对所得文库进行测序。

3. 结果

共检测出 189 例（1.32%）NIPT 阳性病例，其中 113 例（59.79%）经侵入性产前检测确诊。血清学筛查异常（53.14%）是最常见的检测指征，其次是高龄妊娠（23.02%）。

NIPT 对 21 三体（T21）、18 三体（T18）、13 三体（T13）、性染色体异常、其他常染色体非整倍体异常和拷贝数变异（CNV）异常的阳性预测值分别为 91.84%、68.75%、37.50%、66.67%、14.29% 和 6.45%。

在各种产前筛查指征中，颈项透明层（NT）增厚组的阳性率和真阳性率最高（分别为 4.17% 和 3.33%），其次是自愿检测组（分别为 3.49% 和 1.90%）。cffDNA 浓度与孕周（≥10 周）和 NIPT 阳性组的 Z 评分呈线性相关。

cffDNA 全基因组测序对 T21 具有极高的灵敏度和特异性，对 T18、性染色体异常和 T13 具有较高的灵敏度。它还为其他异常染色体核型（CNV 和非 21/18/13 常染色体非整倍体异常）提供了证据。cffDNA 浓度与孕周密切相关，并决定了 NIPT 的特异性。结果强调了 NIPT 的临床意义，它是实现高质量孕期护理的有效产前筛查工具。

3.1 孕妇的年龄和孕周分布

将孕妇按 5 岁间隔分为 8 个年龄组。不同年龄组的孕妇人数见图 1A。数据显示，中国中部地区分娩的孕妇主力军年龄在 25 - 40 岁之间；阳性检测病例也集中在该年龄组，占所有阳性病例的 52.43%（97/185）（图 1C）。最常进行检测的时间是在孕 16 周和 22 周。阳性病例的孕周分布见图 1B 和 1D。

3.2 游离胎儿 DNA 浓度与孕周及 21 三体、18 三体、13 三体 Z 评分的关系

cffDNA 浓度是胎儿非整倍体检测中众所周知的关键因素。作者进一步研究了 cffDNA 浓度及其与孕周和 Z 评分的关系。测量了 5656 份血浆样本中的 cffDNA，并将近 80 份 NIPT 检测为 21 三体、18 三体、13 三体阳性样本的 cffDNA 浓度与 Z 评分进行关联分析。结果表明，cffDNA 含量随孕周显著增加（图 2A）。二者具有显著的正相关性，但相关系数仅为 0.6971，这表明孕周可能与其他机制共同影响 cffDNA 浓度。对 cffDNA 浓度与 NIPT 阳性样本 Z 评分的相关性进一步研究发现，cffDNA 浓度随 21 三体、18 三体、13 三体的 Z 评分显著增加，相关系数分别为 0.744、0.2727 和 0.4338（图 2） 。

3.3 21 三体、18 三体、13 三体的 NIPT 检测结果

在 14316 名孕妇中，共发现 189 例 NIPT 染色体异常阳性病例（表 2）。单胎妊娠和双胎妊娠的阳性检出率没有显著差异（183/13162 与 6/458，P>0.05）。

49 名孕妇检测出 T21 阳性（0.34%），其中 1 名孕妇同时伴有 T13 阳性。48 名患者（97.96%，48/49）接受了介入性产前诊断，45 例被确诊。进一步分析 3 例假阳性病例发现，其 Z 评分 <5，根据试剂盒说明书判断为灰色区域。在确诊病例中，2 例 Z 值 < 5，羊膜穿刺术显示为 21 三体嵌合核型（分别为 47,XN,+21 /46,XN 和 47,XN,+21 /46,XN ）。此外，还有 1 例漏诊 T21 的病例。该孕妇因超声筛查异常被召回并进行 T21 产前诊断。采集该孕妇外周血进行 NIPT 检测，结果仍为阴性；可能的解释是母体胎盘的遗传信息与胎儿不一致。

NIPT 报告 16 例 T18 阳性（0.11%），其中 13 例（81.25%，13/16）接受了产前诊断。其中 11 例确诊，2 例为 Z 值 < 5 的假阳性病例。3 例患者未进行介入性产前诊断，1 例胎儿患有多发性肿瘤，1 例进行了人工流产，1 例发生了自然流产。

NIPT 报告 16 例 T13 阳性（0.11%）。12 例患者（75%，12/16）接受了产前诊断，6 例确诊。4 例患者未进行介入性产前诊断。1 例经 B 超证实有多发畸形。另外 3 例拒绝任何形式的确诊检查并选择继续妊娠。在后续 12 个月的随访中未发现异常，出生后 6 个月内也未发现异常。统计结果见表 2。

这些数据表明，NIPT 对 T21、T18 和 T13 的阳性预测值分别为 91.84%、68.75% 和 37.5%（表 2）。

3.4 性染色体非整倍体的 NIPT 检测结果

NIPT 报告 63 例（0.44%）性染色体非整倍体（SCA）异常，包括 29 例 45,X、16 例 47,XXY、9 例 47,XXX 和 9 例 47,XYY。44 例患者（69.84%，44/63）接受了产前诊断，42 例确诊（19 例 X 单体、3 例部分 X 单体、8 例 47,XXY、2 例 47,XXX、1 例 47,XXX/46,XX 嵌合体和 5 例 47,XYY）。2 例假阳性病例是由于母亲染色体异常（47,XXX）导致的。

NIPT 对性染色体数目异常的阳性预测值为 66.67%（42/63）。其中，XO 的阳性预测值最高，为 75.86%（22/29），其次是 XYY 和 XXY（分别为 55.56% 和 50.0%），XXX 最低（33.33%）。

3.5 产前检测指征与 NIPT 结果

14316 名孕妇进行 NIPT 的临床指征见表 1。母体血清筛查异常（aMSS）组是最常见的指征，占比 53.14%，其次是高龄产妇（AMA）组（23.02%）和自愿检测组（17.63%）。颈项透明层（NT）增厚组的阳性检出率最高（4.17%），自愿检测组次之（3.49%）。NIPT 在不同指征组以及不同指征的阳性病例中，检测能力存在差异。

双胎 / 体外受精 - 胚胎移植（IVF-ET）妊娠组的阳性预测值最高，其次是颈项透明层增厚组，胎儿和胎盘其他超声异常组的阳性预测值最低。阳性预测值最低可能与阳性病例较少以及孕妇拒绝产前诊断有关。不同指征组中 21 三体、18 三体、13 三体和性染色体异常的检出率相似，差异无统计学意义（p>0.05）。

英文缩写： cffDNA：游离胎儿 DNA；NIPT：无创产前检测；CNV：拷贝数变异；NT：颈项透明层；CPM：局限性胎盘嵌合体；SCA：性染色体非整倍体；AMA：高龄产妇；aMSS：母体血清筛查异常；aUS：超声异常发现；BMI：体重指数。

4. 结论

作为一种强大的筛查方法，NIPT 极大地改变了当前产前筛查的现状。随着 NIPT 技术在低风险妊娠人群中的普及以及高通量测序技术的发展，NIPT 检测的受益人群和疾病检测范围也在不断扩大 。全基因组测序 NIPT 通常会获得阳性结果，这些结果可能与胎儿、胎盘和 / 或孕妇的生物学异常有关。在进一步临床检测前，应更加重视遗传咨询和产前诊断。

回顾性数据分析表明cffDNA全基因组测序对 T21 具有极高的灵敏度和特异性，对 T18、性染色体异常和 T13 具有较高的灵敏度。NIPT 还为其他异常染色体核型（CNV 和非 21/18/13 常染色体非整倍体异常）提供了证据。cffDNA 浓度与孕周密切相关，并决定了 NIPT 的特异性。

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