三代全长扩增子——微生物多样性HiFi 3.0时代全面来袭！

  微生物群落研究中，扩增子测序技术就是针对微生物中具有物种特异性序列进行测序。细菌群落的研究更多关注的是16S rRNA的序列，这段序列保守区夹杂着9个高变区构成（下图），不同物种的高变区具有较大差异，因此可作为物种识别的特征性序列开展研究。

 相信主攻微生物领域研究的老师们，一定纠结过到底测细菌16S的哪个区，V3+V4，或者V4+V5？细菌的16S一共有V1-V9九个区，全长约1500+bp，受限于NGS的读长，只能对其中的个别高变区域开展，在属水平进行物种注释，而都无法将其准确注释到种水平。

      有没有方法能够测得16S全长的同时兼顾测序准确率、通量和价格呢？

伴随着三代测序技术的发展，长读长测序技术越来越成为组学研究的主流。PacBio平台3-5kb的平均读长可以轻而易举地覆盖16S rRNA的9个高变区域，16S rRNA全长测序因此成为多样性研究的新热点技术，具有许多明显的优势：

1、三代16sr RNA全长扩增子长读长

PacBio全长16S rRNA基因测序采用27F-1492R引物扩增全长片段（覆盖V1-V9区），采用PacBio SMRT测序平台CCS（Circular Consensus Sequencing）模式进行测序分析，获得的序列更长，信息量更多更准确！

2、三代16s rRNA全长物种鉴定高精准

HiFi reads（High Fidelity reads）是2019年由PacBio推出的基于环化共有序列（Circular Consensus Sequencing，CCS）模式产生的既兼顾长读长（10-20kb）又具有高精度（>99%准确率）的测序结果。PacBio数据下机后，使用仪器自带的SMRTLINK（v9）进行一致性CCS序列（circular consensus sequencing）的获得，CCS序列的准确性达到QV20（99%准确率）水平。

由此可见，微生物16S rRNA三代全长HiFi扩增子兼顾了二代测序准确率、长读长以及数据高通量，对于微生物群落物种鉴定更加灵敏、准确！

从分类鉴定的状况看，基于三代测序，在同一分类水平下，也可以实现更多的物种分类，更是在“种”水平物种鉴定中实现了大幅提升，减少了很多在种属水平上的错误物种分类。这一点就很大程度满足了微生物学研究者的迫切需求。

3、三代16S rRNA全长PCR扩增无GC偏好性

由于二代测序建库过程中有PCR扩增的步骤，难以避免由于扩增偏好性造成的物种丰度检测的偏差。在多个研究中，人们都发现基于二代测序部分高变区的研究，可能造成某些特定微生物类群含量的检测偏差（下图），这就难以实现对样本中微生物群落分布的真实还原。而三代测序由于不需要PCR的过程，无GC偏好性，就很大程度上降低了结果的偏差，数据结果更准确！

4、三代16S全长能够更真实的还原微生物群落结构

2019年有学者在《Nature Communications》期刊报道了基于16S不同高变区和16S全长研究的差异。基于数据库已有信息和计算模拟，评价了不同区域引物在物种识别和还原样本信息上的差异。

下图展示的是扩增子序列不能被识别的序列比例。不难看出V1-V9区引物很少有序列不能被明确分类，相比之下，仅仅开展V4区的研究，则有极高比例的序列无法实现明确分类。

基于模式物种库进行进化树构建，并用红色表示其中不能被明确鉴定的物种，亦可看出，基于部分区域的V4区研究，有很大比例的物种无法实现明确分类。此外，由于研究区域的选择，在一定程度上也造成了分类识别的偏好性。

通过聚类OTU，并与模拟物种库进行比较，研究发现，V1-V9区研究实现了对样本的最佳还原。此外，基于三代技术开展16S全长扩增子研究，有更多的序列得到了明确的物种划分，尤其是针对样本中含量低微的物种，分类鉴定的效果更好。

三代16s rRNA全长扩增子测序能够提高微生物组成鉴定精确度，更真实还原样本微生物群落结构。更长，更稳，更精准！

总之，与二代测序相比，三代PacBio平台可满足16S全长研究需要，特别是PacBio HiFi测序同时兼具通量高、测序时间短、准确性高、无需扩增等优势，伴随着三代测序成本的下降，势必将取代二代测序，成为环境、医口研究领域高分科研论文的不二之选！

重磅好消息来咯！

凌恩生物6.18聚惠来袭！！

三代16S全长测序一万条以上序列仅需249元，三万条以上序列仅需299元

低价赶超二代扩增子研究，有没有很心动呢！

再也不必纠结9个高变区该怎么选，

16s全长扩增子，更精确，更灵敏，更保真！

更有凌恩生物特惠支持，再也不用焦头烂额，研究烦恼统统解决！

欢迎参与活动的老师同学联系当地销售或微信公众号后台留言！

参考文献

1. High-resolution Phylogenetic Microbial Community Profiling. The ISME Journal, 2016. doi: 10.1038/ismej.2015.249

2. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications, 2019. doi: 10.1038/s41467-019-13036-1