肠道微生物在人类健康中有着举足轻重的地位，它掌管着人体70%的免疫力，排除80%的毒素，消化吸收95%的营养物质。随着人类微生物组计划的开展，人体微生态，尤其肠道微生态失衡，已被证实与包括肿瘤、消化系统疾病（如炎症性肠病、慢性腹泻）、免疫系统疾病（如哮喘、过敏、湿疹）、代谢性疾病（如肥胖、糖尿病）、精神类疾病（如自闭症）在内的50多种疾病直接或间接相关。其中，有关炎症性肠病的研究是起步最早、成果最多的领域之一。
2022年，Nature Microbiology期刊，发表Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity。利用多组学联合分析揭示了溃疡性结肠炎(UC)患者功能性微生物群发生改变，并为治疗这种疾病的策略提供了新的方向。
中文标题：多组学联合分析揭示普通拟杆菌的蛋白酶与溃疡性结肠炎疾病严重程度相关
发表时间：2022.02
发表期刊：Nature Microbiology
影响因子：30.964
DOI: 10.1038/s41564-021-01050-
摘要
溃疡性结肠炎(UC)与宿主-微生态的平衡失调有关，目前的研究主要集中在宿主的炎症通路。为了了解UC中宿主-微生态是如何被破坏的，本研究分析了来自40名UC患者的6份多组学数据（粪便样本的宏基因组学、宏蛋白质组学、代谢组学、宏多肽组学和扩增子测序以及血清样品的蛋白质组学图谱）。验证数据包括210份样本（73名UC、117名克罗恩病、20名健康对照）。验证结果表明部分UC患者体内含有过多的蛋白酶，这些蛋白酶来源于普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）。为了检验B.vulgatus蛋白酶在UC疾病活动中的作用，研究者首先分析了患者体内和细菌培养基中的B.vulgatus蛋白酶。使用广谱蛋白酶抑制剂可以改善B.vulgatus诱导的体外屏障功能受损，并预防普通拟杆菌单株IL10- 缺陷小鼠的结肠炎。此外，将具有高丰度B.vulgatus蛋白酶的UC患者的粪便移植到无菌小鼠体内，会诱导小鼠患结肠炎。本研究利用多组学联合分析揭示了UC患者功能性微生物群发生改变，并为治疗这种疾病的策略提供了新的方向。
一、研究背景
炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）。UC被认为与肠道微生物组的破坏有关，但目前并没有任何疗法能真正靶向作用于这些微生物群落。来自加利福尼亚大学等机构的研究者们通过研究识别出了一种能驱动UC的新型微生物酶，并阐明了一种潜在的治疗性干预措施。
二、研究方法
粪便样本的宏基因组学、16s扩增子测序、代谢组学、宏多肽组学、宏蛋白质组学；血清样品的蛋白质组学。
图 实验设计流程图
三、研究结果
1. 与UC严重程度相关的多组学联合分析
UC临床指标之间具有很强的相关性（图1a），研究者筛选出具有代表性的临床指标用于评估IBD的严重程度。在所有的数据中（16s、宏基因组、代谢组、宏蛋白质、宏多肽组学），疾病的严重程度与alpha多样性和beta多样性均显著相关，alpha多样性随疾病严重程度的增加而降低（图1c）。以粪便为研究对象的组学数据之间的相关性强于以血清为研究对象的数据(图2b)。宏蛋白质组对UC预测能力最强，其次是多组学联合分析(图2c)。在UC患者体内可以观察到人类蛋白质的增加（图2d），磷胆碱等代谢物种类与UC活性相关（图2e）。拟杆菌属（Bacteroides）蛋白占与UC疾病活性相关蛋白的40% - 60%(图3a)，但是在宏蛋白质组中，拟杆菌与UC的严重程度相关性比较弱（图3b）。
与疾病活动相关的拟杆菌蛋白功能分析显示，蛋白酶家族的含量增加(图3 c)。B. vulgatus和B. dorei是在健康人群中流常见的物种，它们占UC患者宏基因组数据的40%左右(图3d)。研究者分析了59种拟杆菌属的119种不同的酶和蛋白酶与UC严重程度的相关性，与UC活性最相关的是丝氨酸蛋白酶(图3e)。
通过比较B. vulgatus和B. dorei蛋白酶生产过剩或不足的患者样本，发现与蛋白酶降低组和典型UC患者样本相比，蛋白酶含量增加的患者的临床严重程度和内镜活动显著更高(图3f)。由于丝氨酸蛋白酶主要在细胞外空间发挥作用，研究者推测这些蛋白在胞外蛋白水解和疾病活动中发挥作用。
图1 IBD严重程度与多组学联合分析
图2 IBD疾病活动性的多组学分析
图3 宏基因组-宏蛋白质组联合分析
2. UC患者组学和拟杆菌属上清中蛋白质水解的评估
二肽和寡肽是最常见的与疾病相关的代谢物，分析发现在UC严重的患者粪便样本和Bacteroides蛋白酶生产过剩的患者中发现了更多的肽片段(图4b)。来自人类蛋白质的肽片段主要包括胶原和粘蛋白的结构蛋白(图4c)，这些人类蛋白是UC蛋白酶的潜在靶标。常见的中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶-327的切割模式并不含有识别肽末端的强信号，这表明中性粒细胞蛋白酶可能不是患者蛋白水解的主要贡献者。
图4 UC患者组学和拟杆菌属上清中蛋白质水解的评估
3. 蛋白酶抑制在体外和体内均可预防普通拟杆菌诱导的结肠上皮损伤
利用Caco-2细胞模型检测UC中6种最丰富的拟杆菌属对肠道屏障的影响，发现含量较高的两种拟杆菌属(B. vulgatus和B. dorei)显著降低了TEER（监测离体上皮组织的增长能力，肠道屏障受到破坏，TEER值下降），而其他种类的拟杆菌属则升高TEER。B. vulgatus和B. dorei都有大量与UC活性相关的蛋白酶，B. vulgatus在UC肠道菌群和健康肠道菌群中丰富度更高，因此，研究者选择B. vulgatus作为下一步的重点。通过添加针对丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶抑制剂（PI）来评估蛋白酶对上皮细胞的破坏性。发现PI在接种B. vulgatus后22小时和38小时均显著增加了TEER（图5 a, b)，菌落在不同处理之间没有显著差异（图5c），因此该变化不是由于细菌生长或生存能力引起的。研究者进一步检测B. vulgatus上清液是否对TEER有类似的影响，没有发现显著的影响，这表明起作用的蛋白酶是膜结合的或者其分泌需要应激源(如宿主-微生物相互作用)的刺激。
共聚焦显微镜观察发现B. vulgatus处理的上皮细胞有显著变化(图5 d)，膜内细胞形态分析显示，细胞的圆形明显降低(P=0.0043)，通过PI可以恢复（图5e）。为了研究B. vulgatus蛋白酶在体内的作用，研究者在IL10无菌小鼠模型中对B. vulgatus进行了单定殖，并向一半小鼠的饮用水中添加PI(图5f)。定殖10周后，PI对结肠上皮有保护作用，减轻炎症细胞的浸润程度(图5g)。PI显著改善了组织学结肠炎的严重程度(调整后p=0.0061，图5h)，同时显著降低了B. vulgatus诱导的隐窝增生(调整后P值=0.0028，图5i)。
图 5 蛋白酶抑制保护B. vulgatus粪便移植诱导的体外和体内病理学
4. UC患者粪便中的B. vulgatus蛋白酶移植到无菌小鼠后可导致结肠炎
研究者将UC患者的粪便移植到易发生结肠炎的IL10缺陷无菌小鼠中(图5j)。其中一半的老鼠通过饮用水中添加了PI。根据疾病的主要指标(结肠缩短和脾肿大，图5k,l)和组织病理学分析，移植蛋白酶含量较高粪便样本的小鼠患病更严重（图5m）。PI对饲喂低含蛋白酶粪便样本的小鼠的这些参数没有显著影响，但对饲喂富含蛋白酶粪便样本的小鼠的结肠炎明显减轻。表明UC患者的微生物群增加B. vulgatus蛋白酶有高的结肠炎潜力和建议PI作为治疗干预严重UC。为了证实在粪便移植过程中存在B. vulgatus蛋白酶，对小鼠粪便进行宏蛋白质组学分析，不管是否添加PI，在移植了B. vulgatus蛋白酶含量过多患者粪便的小鼠，其粪便中B. vulgatus蛋白酶含量也增加。
四、主要结论
本研究通过多组学联合分析，发现UC严重程度与B. vulgatus蛋白酶增加有关，PI可以通过抑制蛋白酶而改善UC的严重程度。本研究为进一步研究拟杆菌属蛋白酶抑制作为UC的治疗方法奠定了基础。该实验成果有望改善科学家们对溃疡性结肠炎患者的功能性微生物改变的理解，从而帮助开发治疗溃疡性结肠炎的新型策略。
参考文献
Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity
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