宏病毒组（二）|样本前处理

由于病毒核酸在样本中的相对含量非常低，容易受到宿主基因组的严重干扰，且病毒的结构具有独特性，缺少具有固定保守的进化标记基因，无法通过保守的基因分析来鉴定分类信息，使得宏病毒组研究从样本制备开始到数据分析都存在着一定的困难。目前，从样本制备层面主要有病毒样颗粒（VLP） metagenomes 和 Bulk metagenomes两种。

1 病毒颗粒富集

使用滤膜过滤或CSCl梯度密度离心的方式去除宿主细胞和细菌等污染，以达到富集病毒颗粒的目的。不同的化学试剂与不同的滤膜，对颗粒的富集及后续的数据结果，都会有一定的影响。

图1 VLPs富集处理流程

2 非富集方法

直接从样本中提取DNA/RNA，核酸提取方案如图2。提取的核酸基本包含了当下样本的全部宏基因组信息，其中有1%-17%为病毒DNA(Qin, et al, 2010; Minot, et al, 2011)。

图 2 不同研究目的核酸准备方案

3 不同实验方法结果比较

与未经VLPs富集的实验方法比，三种纯化方式（图3）在去除宿主DNA和细菌DNA均是非常成功的，富集倍数均可达到40000倍以上。其中CsCl方法的富集效果最佳，达到49077倍，FD富集效果最弱，但也有41517倍。这些变化的富集倍数均可表明，在去除细菌DNA时，这三种纯化方式的去除率均可达到99.99%以上（Kleiner M, et al, 2015）。未经VLPs富集的宏转录组方法揭示了高水平的病毒多样性，其中检测到的最丰富的病毒是Caudovirales，Luteo-Sobemo，Narna-Levi，Partiti-Picobirna，Picorna-Calici和Tombus-Noda。相反，VLPs富集后宏基因组方法揭示了相对较低的病毒多样性。Caudovirales占病毒reads中的主要比例（69.89％至99.49％），而Microviridae，Circoviridae, Genomoviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Polyomaviridae, 和Papillomaviridae检测到的丰度较低（图4，上部分为未进行VLPs富集的结果，下面为VLPs富集后的结果）。宏转录组和宏基因组两种方法同时使用，是获得样本中病毒群落分类和功能概况的有力工具(Chong R, et al, 2020)。

图 3 VLPs纯化方法示意图(Kleiner M, et al, 2015)

图4 宏转录组与VLPs富集后宏基因组检测到病毒丰度分布图

4 宏病毒组送样量建议

种类	最低送样量	建议送样量
植物组织	鲜重1g	鲜重1.5g
动物组织	组织鲜重0.5g	组织鲜重1.0g
粪便	鲜重2g	鲜重5~10g
肠道内容物	鲜重2g	鲜重5~10g
水样滤膜	直径3-5cm，5张（1 L）	直径3-5cm，10~15张
土壤	鲜重2g	鲜重5~10g