组学知识快递（三）|蛋白组基础篇

蛋白组学研究的重要性已毋庸置疑，但很多老师在组学技术的选择、样本准备及数据分析等方面仍然存在很多疑问。本文小易总结了一些蛋白质组学的常见问题供大家参考，赶紧学习收藏吧！

Q1  蛋白组研究的常用手段有哪些？

根据目的的不同，蛋白组研究的常用技术手段也有较大差异。

1）双向电泳技术（理想目的：将细胞（或组织）内所有蛋白质都分离开来）；

2）质谱技术及一系列派生技术 （测蛋白质序列）；

3）蛋白质互相作用研究：酵母双杂交，细菌双杂交，免疫共沉淀技术，pull-down，FRET，BiFC等；

4）蛋白质定位：荧光标记技术，共聚焦荧光显微镜技术，免疫荧光，免疫化学等技术。

其中，通量最高，结果转化最快，应用范围最广的技术手段要数质谱技术及一系列派生技术，通过质谱平台，可以对样本中的蛋白进行定性和定量分析，明确不同生长条件，不同生理状态，不同样本之间的蛋白表达差异。

Q2  质谱实现定性定量的原理?

蛋白经酶切后会形成多肽，多肽在质谱的离子源位置会带上正电荷，成为一级母离子飞进质谱的质量检测器，质量检测器输出一级谱图；接下来母离子还会在碰撞池的位置进行氨基酸的依次断键，再进入检测器，输出二级谱，经过与数据库生成的理论谱图匹配，可以判断肽段的氨基酸组成，然后再根据肽段反推出蛋白。一级和二级谱的峰值，根据定量原理的不同，均可以作为蛋白定量的依据。

Q3  蛋白组学技术该如何选择？

Q4  为什么TMT技术建议检测样本为同物种同组织，而DIA和Label-free不受组织限制？

因为TMT是标记后一起上机检测，标记的是所有样本中共有的蛋白，不同组织部位包含的蛋白质差异比较大，如果不同组织部位一起检测会遗漏很多蛋白信息。DIA和Label-free不进行标记，一个个上机检测，因此每个样本的检测都是独立的。

Q5  为什么Label-free的缺失值会比较多，而TMT和DIA缺失值相对较少？

Label-free进行质谱采集时只选取topN的母离子进行二级碎裂和MS2检测，所以会丢失一些丰度较低的肽段信息，缺失值比较多；

TMT使用二级定量报告离子定量，不同样本的丰度信息同时被采集，缺失值非常非常少；

DIA是无偏好的全息扫描，获得的信息全面，稳定性更好，缺失值相对较少。

Q6  蛋白组学样本寄送前是否需要精确计数或是称量？

不同样本寄送会有不同的送样要求，按照收集方法提供可以更好的保证实验用量充足。项目开展前会进行蛋白浓度的测定，后续也是不同样本等蛋白量处理、上机检测，但是要保证每个样本的寄样量达到实验要求。

Q7  血清血浆样本如何选择？

都可以选择使用，血浆含有纤维蛋白原，在血清中检测到的蛋白丰度相对于血浆来说更高，不进行高丰度蛋白去除情况下，一些比较微量的蛋白可能血清才可以检测出。但是血清的操作步骤相对比血浆而言更复杂，可能会带来人为误差。血清血浆预处理完毕后送样量必须大于200ul。

Q8  物种如何选择数据库？

常规是使用uniprot网站中研究物种的蛋白数据库作为搜库文件，如果该物种的数据库比较小或者没有数据库，可以选择以下2种解决方案：1）选择近源物种库，或扩大物种分类层级，选择上一层级或是更大层级的物种库；2）转录组测序结果作为数据库。个别物种有专门的数据库网站可以进行搜库分析。

Q9  如何设置生物学重复？

Q10  进行质谱检测蛋白组的样本应该如何处理、运输和保存？

细胞、组织、蛋白溶液、菌体等样品最好采用收集后液氮速冻，干冰运输，对于SDS-PAGE条带和2D点以及酶解好的肽段样品直接常温运输即可，如果天气较热，路途较远，也可以进行液氮速冻，干冰运输。