皮层-皮层下结构连接支持经颅磁刺激有效地影响杏仁核

杏仁核负责处理具有情感价值的刺激，对情感产生影响，并在焦虑障碍、抑郁症和创伤后应激障碍（PTSD）中表现出异常的神经活动。调控杏仁核活动的治疗手段具有作为跨诊断精神疾病治疗的潜力。在45名健康参与者中，我们探究了经颅磁刺激（TMS）是否能通过作用于腹外侧前额叶皮质（vlPFC）（一个与情感调节密切相关的脑区）来间接改变杏仁核活动。通过应用扫描器内交错的TMS与功能性磁共振成像（fMRI），我们揭示了vlPFC神经刺激能引发杏仁核fMRI BOLD信号的急性和局部调节。更大幅度的TMS诱导的杏仁核变化与vlPFC至杏仁核白质通路中更高的纤维密度有关，但并非与其他解剖学对照有关，这暗示该通路促进了皮层与皮层下之间由刺激引发的信息传递。这项研究为TMS能有效激活杏仁核提供了证据，并突出了通过刺激vlPFC至杏仁核神经回路作为跨诊断精神病理治疗的可能性。这意味着针对皮层-皮层下结构连接的定向干预可能增强TMS对皮下层神经活动的影响，进而影响由皮层下支持的行为。本文发表在SCIENCE ADVANCES杂志。（可添加微信号19962074063获取原文及补充材料，另思影提供免费文献下载服务，如需要也可添加此微信号入群)。

介绍：

     杏仁核是一个关键的神经结构，负责决定个体对情感刺激的生理、情感和行为反应。这个位于内侧颞叶的皮层下脑区为奖励和威胁赋予价值，促进食欲和厌恶性条件反射，并影响正面和负面的内在情感状态以及相关行为（参考文献1-4）。意识地识别和调节与杏仁核相关的情感状态会招募前额叶皮质（PFC），包括负责情感控制和重新评估的腹外侧PFC（vlPFC）区域（参考文献5-11）。杏仁核和vlPFC内的异常活动导致了许多精神疾病诊断中观察到的心理病症状（参考文献11-14）。实际上，对来自超过11,000名个体的任务功能磁共振成像（fMRI）数据的元分析显示，在情感处理过程中，患有情绪、焦虑和压力障碍的患者一致表现出杏仁核的超活跃和vlPFC的低活跃——将这两者归类为与情感调节失常最显著和可靠的神经表型（参考文献11）。因此，能够调节杏仁核活动的治疗手段，尤其是那些同时作用于vlPFC的手段，具有缓解与情感相关的跨诊断症状的潜力。

       经颅磁刺激（TMS）是一种非侵入性的神经调控工具，通过电磁感应产生神经放电的变化，并可能通过直接刺激功能性或结构性连接的皮层区域来间接改变杏仁核活动。在临床上，重复性TMS作用于前额叶皮质（PFC）已经获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准，用于治疗对药物不敏感的重度抑郁症和强迫症，并已在创伤后应激障碍和焦虑障碍的临床试验中进行研究（参考文献15, 16）——所有这些障碍都以杏仁核的超活跃为特征（参考文献11, 13, 14, 17）。然而，尽管对许多患者来说TMS具有明确的疗效，但临床反应仍然是变化多端的，不是所有个体都能体验到症状的缓解。近期的研究表明，前额叶TMS对情绪、焦虑和压力障碍的疗效可能部分取决于PFC与杏仁核之间功能连接的强度（参考文献18-20），进一步暗示疗效可能因TMS改变杏仁核功能的能力而有所不同。然而，迄今为止，关于前额叶TMS能否特异性地调节杏仁核活动的直接证据还非常有限（参考文献18, 21, 22）。此外，尽管这一与心理病理学相关的皮层区域被假设为对杏仁核神经元放电具有自上而下的控制作用（参考文献6, 10），但TMS作用于腹外侧PFC能否引发杏仁核活动的即时、可靠变化仍然鲜有研究。

     TMS通过去极化细胞体和大直径轴突来改变神经活动，从而产生动作电位（23）。尽管TMS只能直接在设备磁线圈下方的皮质表面去极化神经元（24），但实证证据表明TMS还可以在“下游”区域引起间接的活动变化。这一现象最有力的证据来自于运动诱发电位：对侧运动皮质受TMS刺激后记录的手部肌肉电位。这些电位证明，TMS诱导的动作电位可以沿着多突触轴突途径传播，引起远离皮质刺激部位的活动（23）。通过结合TMS与侵入性电极记录（25）或非侵入性fMRI记录（26）的研究提供了额外的实证证据，这些研究揭示了TMS诱导的活动如何按照被刺激皮质的结构性连接组织（27）在大脑中传播。

      结合TMS和fMRI是一种强大的实验操纵方法，因为TMS的单次脉冲（spTMS）可以在MRI扫描仪内与fMRI功能读出交错传送（spTMS/fMRI）。因此，spTMS/fMRI允许在TMS线圈下方改变神经活动，同时使用刺激探针定量测量大脑其他部分（包括次皮质）的效应，构成了一种因果“探测和测量”方法（26, 28）。这种方法的成功是基于TMS引起的生理反应与fMRI采集属性之间的兼容性。具体来说，TMS引起的神经活动变化可靠地被血流动力学变化捕获（24），这驱动了fMRI的血氧水平依赖性（BOLD）信号。TMS对fMRI BOLD的急性反应需要几秒钟达到峰值；因此，在fMRI读出之前可以加入时间延迟，以防止损害功能记录。此外，TMS的单次脉冲短暂地引发神经活动，而不对放电产生累积效应（28），从而使得可以平均单次试验的fMRI对TMS的反应。

      在最近的一项初步研究中，我们的团队在刺激侧面前额叶皮质（PFC）的空间多样化区域时使用了spTMS/fMRI，并证明了TMS可以在亚属前扣带皮层（sgACC）和杏仁核中引起fMRI BOLD信号的下游变化的可行性（22）。关键的是，在这项初步研究中，我们观察到位于或接近vlPFC的刺激部位产生了杏仁核BOLD信号的最大降低。猕猴的纤维追踪工作显示，尽管medial PFC与杏仁核有广泛的连接（29），但大多数侧面PFC区域只有轻微的连接，vlPFC是唯一的例外（7）。vlPFC向杏仁核发送密集的、单突触的输入，因此是唯一一个可以直接接触到TMS的、与杏仁核有大量（而不是稀疏）投射的PFC区域（7, 10）。这些数据支持vlPFC TMS可能特别能够调节杏仁核活动的假设，这是由于刺激诱导的动作电位沿着vlPFC到杏仁核的白质连接传播。然而，人类的vlPFC-杏仁核结构连接研究很少（30）。因此，它们是否可能构成皮质-杏仁核信号在神经调节期间传播的一个关键途径仍然是未知的。         本研究旨在因果地探讨TMS是否可以通过参与皮质-皮质下结构通路对杏仁核产生神经调节效应。为了实现这一目标，我们首先使用基于刺激的探测和测量方法来验证我们最初的发现，即在vlPFC附近施加的刺激（“探测”）会在杏仁核中引起急性功能反应（“测量”）。接下来，我们试图阐明可能允许皮质刺激产生针对性的下游杏仁核反应的结构支架。我们期望在人类和非人类灵长类动物之间鉴定出一个同源的vlPFC到杏仁核的白质通路；此外，我们假设影响信号传导的通路属性会影响TMS对杏仁核活动的程度。我们研究的结果可以用来开发调节与跨诊断情感相关的精神病理学有关的皮质-杏仁核回路的TMS方案。这些结果的扩展到患者群体可能有助于将针对杏仁核的TMS转化为治疗性临床试验。

材料与方法 

实验设计 

     年龄在18至55岁之间的健康参与者，没有现在或以前报告的神经或精神疾病，并且没有使用精神药物的人参与了这项研究。所有参与者在研究参与前都已知情同意，所有程序都得到了宾夕法尼亚大学伦理审查委员会的批准。所有研究程序都按照赫尔辛基宣言进行。最终研究样本中包括的45名个体拥有通过严格的视觉和定量质量控制程序的T1加权、扩散、静息状态fMRI和交错spTMS/fMRI数据（包括杏仁核靶向部位和对照部位数据）。另有9名个体在分析时获得了神经影像数据，但由于过度的运动或图像伪影而被排除在研究之外。排除标准包括在spTMS/fMRI扫描期间的平均相对运动均方根>0.15（排除4名）或在扩散扫描期间的平均帧间位移>0.20，伴随扩散梯度中的运动诱导的有规律的切片丢失（排除2名）或重建的FOD图像（排除3名）。所有神经影像数据都是在两个不同的扫描日在同一台3-T Siemens Prisma MRI扫描仪上获得的，包括基线扫描日和TMS/fMRI扫描日。在基线扫描期间，收集了静息状态fMRI、扩散MRI和T1加权结构MRI序列的数据。静息状态数据被收集用于识别位于或接近左侧vlPFC的参与者特定区域，这些区域与左侧杏仁核表现出强烈的功能连接。这些个性化的PFC-杏仁核功能连接峰值被用作TMS/fMRI扫描日的刺激部位。扩散MRI数据被用来回顾性评估这样一个假设，即TMS诱导的皮质活动变化可能由于前额叶-杏仁核白质通路对杏仁核活动产生下游效应。基线T1加权数据在fMRI和扩散分析流中都被使用。在TMS/fMRI扫描日，TMS在扫描仪中交错应用，与fMRI体积采集交错，以量化杏仁核活动对单次皮质神经刺激的反应中引起的变化。

      TMS刺激部位定位：静息状态fMRI 收集基线静息状态fMRI数据，以便进行fMRI引导的TMS刺激部位选择。在72个交错的轴向切片中，使用反相编码方向获得了两个基线眼睛睁开（注视十字焦点）的多频带静息状态fMRI扫描，采集参数如下：重复时间 = 800 ms，回波时间 = 37 ms，翻转角度 = 52°，视场 = 208 mm，体素大小 = 2 mm^3，420次测量，多频带加速因子 = 8。另外还获得了一个多回波T1加权的MPRAGE扫描，参数如下：重复时间 = 2400 ms，回波时间 = 2.24 ms，反转时间 = 1060 ms，翻转角度 = 8°，体素大小 = 0.8 mm^3，视场 = 256 mm，切片 = 208，使用通用自动校准部分并行采集（GRAPPA）作为并行采集技术。T1加权扫描使用高级归一化工具（ANTS）皮层厚度流线（61）进行处理。静息状态fMRI数据使用可扩展的连接性流线引擎（XCP Engine）（62）进行预处理，以实现一种经过验证的、表现最佳的流线，用于减少fMRI数据中的运动伪影和噪声。fMRI数据的预处理步骤包括合并AP和PA采集，从每次运行中去除前两个体积（volume)以允许扫描仪平衡，将所有体积（volume)重新对齐到平均参考体积，使用AFNI的3dDespike识别和插值时间序列强度异常值，去均值和线性和多项式去趋势，以及使用基于边界的配准将fMRI数据配准到T1加权数据。伪影方差被建模为36个参数的线性组合，包括在预处理期间估计的6个与运动相关的重新对齐参数，深白质中的平均信号，脑脊液室中的平均信号，整个大脑中的平均信号，前9个参数的第一个时间导数，以及前9个参数及其导数的二次项。这36个干扰参数使用一般线性模型从BOLD信号中回归。最后，与混杂回归同时，BOLD时间序列和伪影模型时间序列被时间滤波（一阶Butterworth），使用>0.01和<0.08 Hz的高通和低通滤波器，分别进行。为了将预处理的fMRI数据转换为MNI空间进行功能连接性分析，使用ANTS对称差分形态图像归一化（SyN）将T1加权图像非线性配准到MNI T1模板，然后将变换应用到功能图像上。

      经过预处理后，功能连接性（定义为两个BOLD时间序列之间的Fisher's z变换的皮尔逊相关系数）在左侧前额皮质体素和左侧杏仁核种子之间进行计算，如之前的工作所示（22）。然后将杏仁核功能连接图转换回参与者T1空间，并在每个参与者的曲线重建脑表面上立体定位地可视化，使用神经导航（Brainsight；Rogue Research，加拿大魁北克蒙特利尔）。这个过程允许识别一个在扫描仪内的spTMS/fMRI会话中可以接触到的刺激部位，该部位与左侧杏仁核具有高度的功能连接性，并且定位于（或最接近）vlPFC。在TMS/fMRI扫描日，使用Brainsight神经导航系统确定头皮上的位置（标记在一个固定的lycra泳帽上），垂直于针对杏仁核的皮质刺激部位；TMS线圈位于这个位置的中心。值得注意的是，对于大多数参与者，vlPFC内部存在高度的杏仁核功能连接区域，但对于某些个体，前额叶-杏仁核连接峰值另外定位于背外侧PFC。对于这些个体，选择位于vlPFC最近的前额叶-杏仁核功能连接峰值作为刺激部位。所有针对杏仁核的刺激部位坐标都提供在表S1中。处理过的静息状态fMRI数据还用于定义次要的活动刺激部位，位于左侧中部或上部前额回，这些部位作为本研究的对照。次要刺激部位是为了一个互补的spTMS/fMRI研究，该研究调查了TMS对次膝前回皮质的影响，并在目前的工作中用于路径对照分析。因此，次要刺激部位是为了与左侧亚属前扣带皮层（sgACC）的高功能连接性而选择的，而不是为了与杏仁核本身的低功能连接性而选择的。这些部位是在Brainsight中使用种子到体素功能连接图选择的，这些图是使用亚属（subgenual）种子点生成的，如之前的工作所示（22）。

TMS诱发反应量化：扫描仪内交错spTMS/fMRI

       我们在应用TMS时获得了扫描仪内交错的spTMS/fMRI扫描，使用双相脉冲对头皮位置进行刺激，该位置将刺激集中在距离vlPFC最近的PFC-杏仁核功能连接峰值上。一个MRI兼容的TMS线圈（MagVenture MRI-B91风冷线圈）被定位以诱导一个后向-前向电流（第一相），并以个体静息运动阈值的120%的刺激强度应用。在扫描前立即在MRI室内确定静息运动阈值，并定义为在10次连续试验中在右手（在拇指外展肌或第一背侧骨间肌中）引起可视观察的运动活动所需的刺激强度。使用TMS兼容的鸟笼头线圈（RAPID四通道T/R单通道；Rimpar，德国）获得spTMS/fMRI扫描。在扫描过程中，MRI-B91 TMS线圈连接到MagPro X100刺激器（MagVenture；Farum，丹麦）并由定制的TMS线圈支架牢固地固定在位。spTMS/fMRI采集参数包括：重复时间 = 2000 ms，回波时间 = 30 ms，翻转角度 = 75°，视场 = 192 mm，体素 = 3 mm x 3 mm x 4 mm，32个交错的轴向切片，和178次测量。使用E-prime 2.0（心理学软件工具；Sharpsburg，宾夕法尼亚州，美国）通过并行端口发送的TTL触发脉冲用于控制fMRI体积（volume)采集和单个TMS脉冲的时序。单个fMRI体积(volume)采集之间有一个400毫秒的窗口，期间传送一个TMS脉冲（在200毫秒时触发）。这种时间间隔允许以一种不会在后续体积(volume)采集期间污染磁场的方式施加TMS脉冲。spTMS/fMRI扫描被分成12个spTMS/fMRI小块，其中总共施加了71个TMS脉冲。每个小块由七个400毫秒的窗口组成，其中TMS可以交错地传送，与七个fMRI体积(volume)采集交错。为了纳入零到两个捕获试验，TMS在小块的400毫秒窗口中的五到七次中被施加，这样可以防止预测何时会施加TMS。小块之间由七个fMRI体积(volume)采集分隔。

    针对杏仁核的spTMS/fMRI数据使用XCP Engine的任务模块进行预处理，该模块执行FMRI专家分析工具（FEAT；版本6.0.0）。功能数据使用FSL MCFLIRT的六个标准运动回归器进行了运动校正，高通时间滤波（截止频率为100），空间平滑（5毫米半高全宽核），使用基于边界的配准将fMRI数据配准到基线T1加权图像，并使用预先计算的T1-MNI配准转换将其转换到MNI空间。对于事件建模，每个TMS脉冲被视为一个瞬时事件，并与伽玛形状的血流动力学反应函数进行卷积。在模型估计之后，参数估计和对比值被用来计算从无刺激（隐式基线）到刺激的BOLD信号的百分比变化。然后在左半球亚皮层结构中使用哈佛牛津亚皮层图谱量化平均百分比BOLD信号变化，得到特定区域的TMS诱发反应。我们确认了这种分割选择不会影响spTMS/fMRI诱发反应的量化，通过建立响应估计在使用哈佛牛津图谱和个体FreeSurfer分割时高度相似（哈佛牛津和FreeSurfer导出的左侧杏仁核TMS诱发反应估计的皮尔逊r = 0.96）。spTMS/fMRI诱发反应还在左侧基底外侧、表面和中心内侧杏仁核细分中使用基于组织学的Juelich图谱的离散分割进行量化。正的spTMS/fMRI诱发反应表示TMS诱导的BOLD信号增加，而负的诱发反应表示TMS诱导的BOLD信号减少。spTMS/fMRI诱发反应的大小指数表示响应的整体大小，而不考虑方向（即绝对值），并提供了由神经刺激引发的功能反应的强度的见解——从而捕获了本研究中的主要神经生物学效应。最后，在同一TMS/fMRI扫描日，使用TMS针对亚属扣带回获得了第二个spTMS/fMRI扫描，采用伪随机计数平衡设计。亚属扣带回定位的spTMS/fMRI扫描的获取和处理与上述针对杏仁核定位的扫描完全相同。

前额叶-杏仁核白质通路划定：扩散MRI 

      我们的扩散MRI分析工作流程旨在确定起源于皮质刺激区域的白质连接是否可以作为TMS诱导的信号传输到杏仁核的通路。扩散数据在64个梯度方向上获得，b = 1000 s/mm2（和一个b = 0的体积），参数如下：重复时间 = 4000 ms，回波时间 = 72.60 ms，翻转角度 = 90°，体素大小 = 2 mm3，切片数 = 76。数据使用QSIPrep 0.6.3RC3进行预处理，这是一个集成了来自不同软件的算法的容器化流程，并使用该领域最佳工具实现了关键的预处理步骤（63）。在QSIPrep中，数据使用Marchenko-Pastur主成分分析进行去噪，使用FSL eddy进行头部运动和涡流校正并替换异常值（64），并使用由幅值和相位差异图像生成的场图进行磁敏感失真校正。从预处理的扩散数据中得到的非扩散加权参考图像（b = 0）被配准到一个去颅骨的、AC-PC对齐的T1加权图像。然后应用单个BSpline插值，既对扩散数据进行上采样到1.3-mm3体素分辨率，又使其与AC-PC对齐的T1加权图像对齐。 

       所有后续的扩散分析，包括使用高阶扩散模型的信号重建、纤维束追踪和固定度量量化，都是按照MRtrix3（65）推荐的流程实现的，使用MRtrix3Tissue版本5.2.8。使用MRtrix3 Tissue，扩散图像使用单壳三组织约束球面反卷积（66）重建，使用dhollander算法（67）估计的一组群平均白质、灰质和脑脊液响应函数。约束球面反卷积(CSD)用于重建，因为它允许通过估计FOD来划定每个体素中的多个解剖学准确的纤维群。每一组对称的FOD波瓣代表一个不同的纤维群；波瓣的形状和幅度可以提供关于纤维微结构的信息。关键是，在反卷积过程中可以通过分别求解三组织的响应函数，以去除来自灰质和脑脊液的额外轴突外信号贡献，提高FOD的估计准确性和纤维密度指标的生物特异性。

      在构建了参与者的FOD图像之后，图像经过三组织偏置场校正和全局强度归一化，以确保所有图像中的绝对FOD幅度是直接可比的。然后使用所有参与者的归一化FOD数据创建了一个特定于研究的FOD模板。使用该模板进行基于FOD的纤维束追踪（iFOD2算法，MRtrix3默认参数，250万条流线），生成了一个全脑纤维束图（68）。随后，提取了在一个组TMS刺激位点mask和左杏仁核mask中终止的流线——划定了一个可能支持TMS诱导的动作电位传播的vlPFC–杏仁核结构通路。TMS刺激位点mask是一个特定于研究的mask，由围绕每个参与者的杏仁核定位的TMS位点生成的1.2厘米直径的球体组成。选择这个球体体积是为了包围刺激位点周围可能直接经历过超阈值神经元激活的组织，同时保持围绕个性化刺激位点的空间特异性。使用哈佛牛津亚皮层图谱来描绘左杏仁核。为了量化构成提取的vlPFC–杏仁核通路的纤维群中的参与者特异性测量，实施了一个基于fixel的分析流程，如前文详细描述（69）。vlPFC–杏仁核通路的纤维束被映射到个体的fixel，然后计算每个参与者在与通路相对应的fixel上的平均纤维密度和平均纤维横截面。根据之前的研究（70）使用一个主要的流线到fixel的映射阈值为五条流线，以确保白质通路的稳健性。但是，我们验证了在2、4、6、8和10条流线的映射阈值下，发现是可重复的。纤维密度，由FOD波瓣的积分量化，是一个微结构测量，表示通路的轴突内体积与组织单位体积的比值（考虑到交叉纤维），对轴突数量和堆积密度敏感（71）。纤维横截面是一个形态学测量，由单个参与者非线性变形到模板过程的雅可比行列式计算，受到白质通路直径的影响。按照MRtrix3文档的建议，对纤维横截面进行了对数变换以确保正态性。

      在特定于研究的FOD模板上进行纤维束追踪，而不是在单个参与者的FOD图像上进行，为本研究提供了许多优势。与单个FOD图像相比，特定于研究的FOD模板具有更高的信噪比和与每个FOD相关的减少的不确定性（71）。更好的FOD重建质量支持了改进的纤维束追踪性能，并降低了对虚假纤维束的易感性，从而可能增加了识别路径的解剖学有效性。基于特定于研究的纤维束图提取感兴趣的纤维束也确保只有在整个研究人群中都有良好代表性的白质通路被分析。描绘高度代表人群的纤维束允许进行更合适的跨物种比较（即，人类纤维束追踪与猕猴纤维束追踪之间）和更适当的个体间比较。具体来说，通过优化个体之间的vlPFC–杏仁核通路的解剖学对应关系，模板方法确保了通路纤维密度的个体差异不能简单地归因于通路本身的描绘差异。这是至关重要的，因为我们小组过去的工作已经显示，如何提取白质通路的纤维束的变异性可以产生人为的感兴趣的微结构测量差异（72）。最后，模板方法还允许检查基于参与者到模板FOD变形的宏观结构形态学测量。

统计分析

      统计分析是在R 4.0.2中进行的。进行了双侧单样本t检验，以确定当在vlPFC附近刺激时，左杏仁核、右杏仁核和左杏仁核亚区（独立测试）的平均TMS诱发反应是否显著大于或小于0。然后进行了双侧独立样本t检验，以评估显示负面与正面杏仁核诱发反应的参与者在刺激位点功能连接性或解剖位置（Y和Z坐标）方面是否存在差异。对于亚皮层特异性分析，通过确认配对差异的正态性，使用双侧配对样本t检验评估杏仁核诱发反应大小与其他亚皮层结构的诱发反应大小之间的差异。所有的t检验都是使用t.test函数（R中的stats包）进行的；相应的效应大小是使用cohensD函数（lsr包）估计的。为了比较在针对vlPFC位点和活动控制位点时的左杏仁核诱发反应大小，使用了双侧配对的Wilcoxon符号秩检验（mu = 0），因为配对差异是非正态分布的（wilcox.test函数，stats包）。

      非参数的Spearman秩相关（由rs表示）被用来确定杏仁核TMS诱发反应的大小与距离校正的刺激强度以及与其他亚皮层结构的反应大小之间的相关性。为了将TMS诱发反应与扩散衍生的测量值相关联，使用了Spearman秩偏相关（由rs.partial表示）来控制年龄，量化TMS诱发反应与白质纤维密度或纤维横截面之间的关联。纤维横截面分析还包括颅内容积作为一个协变量，因为这个形态学测量与大脑大小强烈相关(73)。完整的和部分的Spearman相关性是使用cor.test（stats包）和pcor.test函数（ppcor包）实现的；相关系数的置信区间是使用cor_to_ci函数（correlation包）估计的。最后，为了解决在显示负与正杏仁核反应的参与者之间vlPFC–杏仁核通路径纤维密度与左杏仁核TMS诱发反应幅度之间的关联是否有所不同，我们拟合了一个线性模型，其中绝对值诱发反应幅度作为因变量，年龄和纤维密度与反应方向之间的交互作为独立变量（lm函数；stats包）。在所有分析中，当在分析中检查多个亚皮层结构时，应用假发现率校正来校正多重比较（由PFDR表示）。

结果

      我们利用了一个独特的多模态数据集，通过皮层刺激来因果地探测杏仁核的fMRI反应，并回顾性地研究反应的大小是否与皮层-杏仁核白质连接的结构特性相关（图1）。这个数据集包括来自45名健康个体（年龄范围18至55岁，平均年龄28 ± 8.6岁；27名女性）的静息态fMRI、结构和扩散MRI以及扫描仪内交错的spTMS/fMRI数据。这些参与者的样本与我们的初步TMS/fMRI样本（22）没有重叠。为了研究非侵入性皮层刺激如何影响杏仁核，我们在扫描仪中应用TMS脉冲到由功能连接性指导的个体特异性刺激位点，并检查亚皮层的fMRI读数。为了探索杏仁核spTMS/fMRI功能反应与皮层-亚皮层结构连接之间的关系，我们使用纤维取向分布（FOD）tractography重建了刺激区域与杏仁核之间的白质连接。

图1. 多模态分析工作流程。

spTMS/fMRI：在fMRI体积采集之间施加TMS的单脉冲。TMS脉冲被传递到由fMRI指导的、个性化的左前额叶刺激位点。功能时间序列通过eXtensible Connectivity Pipeline (XCP) Engine的任务模块使用FMRI Expert Analysis Tool (FEAT)进行分析；每个TMS脉冲被建模为一个瞬时事件。通过平均由刺激引起的与事件相关的BOLD信号变化，为每个参与者量化了左杏仁核的TMS诱发反应。

扩散MRI：扩散数据使用QSIPrep进行预处理。预处理图像使用MRtrix的单壳三组织约束球面反卷积流线重建，生成FOD图像。然后使用FOD tractography生成全脑tractogram。隔离了连接左杏仁核到TMS刺激的前额区域的结构路径，并量化了路径纤维密度。

vlPFC(腹外侧前额叶皮层)TMS调节杏仁核的BOLD活动 

     我们使用扫描仪内交错的spTMS/fMRI复制了我们之前的初步研究(22)在一个更大的、独立的样本中，并确认皮层刺激对杏仁核，我们的下游目标，产生神经调节效应。对于每个参与者，选择了一个个性化的左前额叶TMS刺激位点，该位点与左杏仁核显示出强烈的功能连接性（基于静息fMRI；参见材料和方法），并位于vlPFC内部或最接近vlPFC的位置。考虑到之前的证据表明，如果下游区域与皮层刺激位点强烈地功能连接，皮层TMS将引起与下游区域相关的更大的生物行为变化(22, 31-35)，因此使用了功能连接性指导的方法。我们关注左侧PFC，因为有大量的证据证明TMS对这个区域的安全性和有效性，用于减少精神疾病的症状(15, 16)。特别是基于我们的初步研究(22)、这个皮层区域对TMS的可接近性和灵长类tract-tracing工作(7)，优先考虑左vlPFC附近的高功能连接性位点。因此，大多数个体特异性的刺激位点直接位于vlPFC内，尽管选择的功能连接性指导的TMS位点位于解剖学上的vlPFC之外的更多的背侧前额叶区域内（图2A）。

图2. 杏仁核BOLD信号变化，随着TMS施加到vlPFC连接峰值。

     (A) 每个参与者的针对杏仁核的TMS刺激位点在标准（MNI）空间中的可视化。个体特异性的刺激位点定位于左前额叶区域，该区域与左杏仁核强烈地功能连接，并且位于vlPFC内部，或者在所有连接峰值中最接近vlPFC的位置。

    (B) TMS引发了同侧杏仁核的显著fMRI反应。为所有参与者绘制了左杏仁核的有符号TMS诱发反应（TMS ER），以及相应的箱线图和小提琴图。对于大多数参与者，传递到连接信息刺激位点的TMS脉冲减少了杏仁核的BOLD信号，如负TMS ER所示。

     (C) 为了评估针对杏仁核的TMS是否在左杏仁核中引发了比非靶向的皮层下结构更大的功能反应，将TMS 诱发反应的幅值与杏仁核和左苍白球（Pal）、尾状核（Caud）、壳核（Put）、海马（Hipp）、丘脑（Thal）和伏隔核（Acc）之间进行了比较。对于每个参与者，从杏仁核的绝对值TMS ER中减去这六个控制结构的绝对值TMS ER，并绘制了TMS ER幅值的差异。位于y = 0线以上的数据点表示参与者在杏仁核中的TMS ER幅值大于指示的皮层下区域。

      为了实证评估spTMS对同侧杏仁核活动的影响，我们测量了由刺激事件引起的BOLD信号的百分比变化，相对于没有刺激的隐性基线。我们将这种由TMS引起的fMRI BOLD信号变化称为TMS“诱发反应”。当神经刺激的脉冲产生与时间锁定的fMRI BOLD信号减少时，TMS诱发反应为负。当刺激脉冲引起fMRI BOLD信号增加时，TMS诱发反应为正。正和负的杏仁核诱发反应都提供了证据，证明皮层刺激对亚皮层活动的瞬时变化，因此证明了支持TMS信号传播的皮层-亚皮层通路。有符号诱发反应的方向和无符号诱发反应的总幅度提供了关于亚皮层中TMS效应的性质和强度的互补信息。在这里，我们研究了有符号的TMS诱发反应，定义为BOLD信号的原始正或负百分比变化，以及诱发反应的幅度，定义为反应的绝对值的大小。

       在45名研究参与者中，左杏仁核诱发反应的平均幅度为0.21% ± 0.14。0.20%的BOLD信号变化在幅度上与功能性激活杏仁核的任务产生的BOLD效应相当(36-38)，这表明应用于皮层可接触位点的spTMS引发了杏仁核的功能反应。通过检查每个参与者的TMS诱发反应的方向，发现TMS脉冲在45个个体中的30个中减少了左杏仁核的BOLD信号（图2B），这种方向效应可能表明杏仁核的去活化。因此，人口估计的有符号TMS诱发反应是负的，并且与0显著不同[平均有符号诱发反应= -0.09% ± 0.24，t44 = -2.51，Cohen’s d = 0.37，95%置信区间(CI) = [−0.16至−0.02]，P = 0.0160]，这与刺激脉冲倾向于抑制杏仁核活动的观点一致。我们对基于概率组织学图谱定义的边界的杏仁核的三个亚区的诱发反应方向性进行了初步分析（图S1）。左基底外侧杏仁核的有符号TMS诱发反应是显著的且为负（平均有符号诱发反应= -0.12% ± 0.22，t44 = -3.51，Cohen’s d = 0.52，95% CI = [−0.18至−0.05]，PFDR = 0.0031），但左外侧或中心内侧杏仁核亚区的反应不显著（平均有符号诱发反应分别为-0.06%和0.05%，PFDR = 0.1701和0.2531）。因此，基底外侧杏仁核的反应方向性最为均匀，75%的参与者在这个区域显示了TMS诱导的BOLD信号减少的模式，这可能导致了整体杏仁核的方向效应。

      接下来，为了确定刺激协议的个体化方面是否影响左杏仁核诱发反应的方向，我们考虑了反应方向是否与TMS刺激位点的功能连接或解剖位置有关。刺激位点与左杏仁核之间的功能连接强度在显示负面与正面左杏仁核TMS诱发反应的参与者之间没有差异（t43 = 0.17，Cohen’s d = 0.05，95% CI = [−0.08至0.09]，P = 0.8683）。负面和正面诱发反应组在TMS应用的前后位置（t43 = −0.80，Cohen’s d = 0.25，95% CI = [−5.85至2.52]，P = 0.4264）或上下位置（t43 = 0.66，95%，Cohen’s d = 0.21，95% CI = [−2.83至5.56]，P = 0.5146）上也没有差异，这是根据标准空间中的刺激位点Y和Z坐标确定的。这三个因素也与有符号的TMS诱发反应没有连续的关系（Spearman’s相关性，所有P > 0.05）。因此，TMS的下游、固有反应的变异性不能容易地从皮层刺激位点的特征预测，尽管值得注意的是，所有的位点都是为了与杏仁核的高功能连接性和与vlPFC的最小距离而选择的。

     对于所有参与者，TMS应用于左PFC的强度为个体预扫描静息运动阈值的120%。然而，头皮与皮层之间的距离，这会影响在皮层产生的电场的强度，通常在个体的初级运动皮层和前额叶刺激位点之间是不同的。因此，如果头皮到皮层的距离在PFC处更大，或者在M1处更大，最终传递到PFC的神经刺激的强度可能小于120%的运动阈值，或者大于120%。因此，我们根据在刺激位点相对于M1的头皮到皮层的距离的个体内差异，对TMS刺激强度进行了校正（39）。我们观察到，传递到左PFC的神经刺激的有效强度在参与者之间有所不同（平均距离校正的刺激强度=运动阈值的110% ± 15%）。值得注意的是，神经刺激的有效强度与左杏仁核TMS诱发反应的幅度显著正相关（rs = 0.35，95% CI = [0.06至0.59]，P = 0.0173），这提供了证据，表明相对刺激水平影响了诱发的杏仁核fMRI反应的幅度。绝对刺激器输出（% of max）与左杏仁核诱发反应不相关（rs = −0.09，95% CI = [−0.38至0.22]，P = 0.5764），这表明，为距离校正的个体确定的运动阈值可能比原始刺激器输出更能洞察在皮层诱导的电场的强度。

       在我们对与spTMS应用同侧的杏仁核事件相关活动的事先分析之后，我们还探讨了是否在对侧（右侧）杏仁核中存在TMS效应。右杏仁核的TMS诱发功能反应与左杏仁核刺激反应在方向和幅度上都是耦合的，这是由右和左杏仁核有符号诱发反应之间的强烈相关性（Pearson’s r = 0.71，95% CI = [0.52至0.83]，P < 0.0001）和绝对值诱发反应幅度之间的相关性（Pearson’s r = 0.41，95% CI = [0.14至0.63]，P = 0.0048）揭示的。相应地，与左杏仁核一样，右杏仁核的TMS诱发反应在群体水平上也显著为负（平均有符号诱发反应 = −0.08% ± 0.25，t44 = −2.04，Cohen’s d = 0.30，95% CI = [−0.15至−0.001]，P = 0.0473），刺激脉冲导致28名参与者的右杏仁核BOLD信号减少。总的来说，这些结果表明，侧化的皮层脑刺激可以调节双侧杏仁核的fMRI BOLD活动。

    

vlPFC TMS在亚皮层的效果是可区分的 

       我们接下来希望评估TMS在亚皮层内的下游效果的特异性。我们预期TMS会在左杏仁核中引起比非靶向的左半球亚皮层结构更大的功能反应。因此，我们将左杏仁核的TMS诱发反应的幅度与左尾状核、海马、伏隔核、苍白球、壳核和丘脑的反应幅度进行了比较。分析是基于绝对值的TMS诱发反应使用的是被试内设计，并专注于与TMS刺激同侧的亚皮层区域。我们在这里分析了绝对值的诱发反应，因为我们对TMS效应的整体大小是否在杏仁核和其他亚皮层结构之间有所不同感兴趣，而不考虑区域诱发反应方向（正面与负面）的差异。在左vlPFC附近的杏仁核功能连接峰值处施加的spTMS引起了左杏仁核中BOLD信号的更大幅度变化，而不是左尾状核（t44 = 4.86，Cohen’s d = 0.72，95% CI = [0.06至0.15]，PFDR < 0.0001）、左海马（t44 = 2.49，Cohen’s d = 0.37，95% CI = [0.01至0.07]，PFDR = 0.0201）、左苍白球（t44 = 4.30，Cohen’s d = 0.64，95% CI = [0.05至0.14]，PFDR = 0.0003）、左壳核（t44 = 4.06，Cohen’s d = 0.61，95% CI = [0.04至0.13]，PFDR = 0.0004）和左丘脑（t44 = 2.14，Cohen’s d = 0.32，95% CI = [0.003至0.10]，PFDR = 0.0381）。相反，左杏仁核的诱发反应的幅度小于左伏隔核，这表明杏仁核和伏隔核可能共享TMS可靶向的皮层表示（t44 = −3.46，Cohen’s d = 0.52，95% CI = [−0.26至−0.07]，PFDR = 0.0018；28个中的28个个体都有负的伏隔核诱发反应）。左杏仁核与其他六个亚皮层区域之间的TMS诱发脑反应的幅度差异在图2C中为每个参与者显示；大多数数据点都落在y = 0线之上，表示在杏仁核中诱发的反应在幅度上始终较大。

       为了进一步探索TMS对其他亚皮层反应是否与杏仁核诱发反应功能性地连接，我们将左杏仁核的BOLD信号变化的幅度与上述亚皮层结构的信号变化的幅度进行了相关分析。左杏仁核的诱发反应幅度与左海马的诱发反应幅度强烈相关（rs = 0.59，95% CI = [0.36至0.75]，PFDR = 0.0001），这可能是由于众所周知的区域间连接或空间上接近的皮层输入的结果。然而，左杏仁核的诱发反应与左尾状核、伏隔核、苍白球、壳核或丘脑的诱发反应没有相关性（所有PFDR > 0.15），这表明个体亚皮层区域在很大程度上显示出对vlPFC TMS的独特功能反应。这些发现揭示了spTMS对fMRI信号的影响不仅可以在亚皮层区域之间区分，而且在杏仁核中的幅度几乎普遍更大——我们希望通过皮层功能连接来靶向的亚皮层结构。

     

白质连接为杏仁核调节提供了一条途径 

       我们假设，由于沿左前额叶-杏仁核白质路径的动作电位传播，TMS诱导的皮层神经元激活可能对杏仁核产生下游影响。为了回顾性地探索这一假设，我们首先创建了一个组合了所有参与者的45个个体化的杏仁核靶向位点的TMS刺激位点掩模。然后，我们从特定于研究的FOD模板生成了一个全脑纤维束图，并提取了在组刺激掩模和左杏仁核中有端点的纤维束。在这项研究的背景下，使用特定于研究的FOD模板进行白质划定和特征分析提供了许多优势。简而言之，与个体FOD图像相比，FOD模板具有增加的信噪比和减少的重建不确定性，从而使得纤维束成像算法的性能更优越，路径识别更准确。此外，模板进一步优化了研究路径在参与者之间的解剖对应关系，消除了路径定义的变异性，这些变异性可能被误解为微结构测量中的个体间差异。最后，模板方法允许识别一个可以跨物种比较的代表性人群路径。我们的扩散MRI分析确定了一个连接左vlPFC到左杏仁核的白质路径（图3A）。这个结构连接从vlPFC开始，向后延伸，然后在中间的亚皮层结构周围弯曲向下，并通过颞叶投射到杏仁核。其前额纤维终点与下额-枕束和钩状束的纤维重叠，而通路的主干与前丘脑辐射一起行进。这个人类vlPFC-杏仁核路径与恒河猴中用侵入性纤维束追踪确定的主要侧前额叶-杏仁核路径非常相似（7）。具体来说，非人灵长类动物纤维束追踪工作已经显示，从侧前额叶到杏仁核的最强直接（单突触）投射起源于恒河猴的vlPFC中的L12区，这在很大程度上对应于人类的Brodmann区域47（BA47）和前BA45（10）。使用在MRI空间中重建的Brodmann图谱（40），我们确定了路径纤维束终点占据的PFC区域的60%位于BA47和BA45（27%位于BA10，13%位于前/腹BA46），证实了我们的工作重现了非人灵长类动物中纤维束追踪观察到的连接空间模式。关键的是，这条左vlPFC-杏仁核路径可以作为一条因果路径，通过这条路径，TMS诱导的vlPFC活动调节产生了对侧杏仁核的下游变化。

图3. vlPFC-杏仁核白质路径解剖 。

(A) 连接左vlPFC刺激区域到左杏仁核的白质路径可以为下游调节杏仁核提供结构支架。该路径是通过FOD纤维束成像识别的，路径纤维束被映射到单个纤维束元素（也称为“fixels”）以计算纤维密度。左边的框显示终止于杏仁核的路径纤维束。中间的框显示按纤维密度缩放的路径FODs。右边的框显示路径fixels。颜色代表纤维方向。

(B) vlPFC-杏仁核白质路径轨迹。所识别的vlPFC-杏仁核路径以绿色显示，叠加在JHU ICBM纤维束图谱的四个主要白质束上，包括前丘脑辐射（ATR）、胼胝体（CC）、下前额-枕叶束（IFOF）和钩束（UF）。

路径纤维密度与TMS诱发的杏仁核反应的幅度相关 

      如果皮层的神经刺激通过激活这个vlPFC-杏仁核白质路径导致同侧杏仁核fMRI信号的下游变化，那么路径导出的测量应该与杏仁核诱发反应的幅度相关。特别是，更高的路径纤维密度应该通过允许更有效的信号传播和增强的皮层输入到杏仁核来产生更大的杏仁核诱发反应。为了为每个研究参与者量化vlPFC-杏仁核路径中的纤维密度，路径纤维束被映射到路径经过的每个体素中的单个纤维束元素，并估计路径fixels的平均纤维密度。为了支持基于回路的皮层-下皮层TMS信号传播模型，左vlPFC-左杏仁核白质路径中纤维密度较高的个体显示出显著更大幅度的左杏仁核TMS诱发反应（rs.partial = 0.36，95% CI = [0.07 to 0.60]，P = 0.0164）（图4A）。纤维横截面，一种宏观的、形态学的路径横截面直径的测量，与杏仁核诱发反应的幅度没有关联（rs.partial = −0.12，95% CI = [−0.40 to 0.19]，P = 0.4610）。

图4. 白质路径纤维密度影响杏仁核TMS诱发反应。

(A) 在所有参与者中，更高的vlPFC-杏仁核白质路径纤维密度与左杏仁核的更大的绝对值TMS诱发反应（TMS ER）幅度相关。深紫色圆圈代表显示出负TMS ER的参与者；浅紫色圆圈代表显示出正TMS ER的参与者。

(B) 在显示出负TMS ER的个体中，更高的vlPFC-杏仁核路径纤维密度与BOLD信号的更大减少相关（深紫色），而在显示出正TMS ER的个体中，与BOLD信号的更大增加相关（浅紫色）。 

(C) 除了主要的spTMS/fMRI扫描，其中TMS被应用到靠近vlPFC的杏仁核定位点外，每个参与者还接受了一个额外的spTMS/fMRI扫描，其中TMS脉冲被应用到路径控制分析中使用的次要活跃点。所有个性化刺激点的强度加权重心分别为vlPFC点（紫色）和活跃控制点（绿色）。

(D) 当TMS被应用到远离路径端点的活跃控制点时，vlPFC-杏仁核路径纤维密度与左杏仁核TMS ER幅度之间的关联强度（rho）显著减小。

      在这次主要分析之后，我们努力了解vlPFC-杏仁核路径是否被那些对TMS反应导致左杏仁核fMRI活动减少或增加的个体有所不同地参与。因此，我们研究了路径微结构与杏仁核诱发反应幅度之间的关系是否取决于诱发反应的方向（正或负）。我们在一个线性模型中测试了这种依赖性，该模型中有一个交互项，该项是纤维密度和反应方向用于预测绝对值反应幅度。交互项不显著（t4,40 = 0.47, 估计 = 0.79, P = 0.6392），这表明在显示杏仁核中负和正刺激诱导的功能反应的参与者之间，诱发反应幅度与路径传导性之间的关系没有差异。为了进一步确认识别的vlPFC-杏仁核路径的重要性，无论杏仁核诱发反应的方向如何，我们评估了路径纤维密度与有符号诱发反应之间的关系，这在负和正杏仁核反应者群体中是独立的。当只考虑那些对TMS有负诱发反应的左杏仁核的个体（N = 30）时，更高的纤维密度显著地与左杏仁核BOLD信号的更大减少相关（rs.partial = −0.38, 95% CI = [−0.66 to −0.01], P = 0.0439）（图4B，深紫色）。相应地，在正杏仁核反应者群体中（N = 15），更高的路径纤维密度与左杏仁核BOLD信号的更大增加相关（rs.partial = 0.27, 95% CI = [−0.29 to 0.70], P = 0.3422）（图4B，浅紫色），尽管这种关联不显著，可能是因为样本量不足。总的来说，这一系列互补分析突显了研究无符号诱发反应幅度的实用性，并证明了vlPFC-杏仁核路径的结构特性与所有参与者的皮层-杏仁核刺激传播相关。

       在一系列的敏感性分析中，我们因此确认了左杏仁核TMS诱发反应幅度较大与左vlPFC-杏仁核路径纤维密度较大之间的关联，并不是由神经刺激的强度、基线刺激部位与杏仁核功能连接的强度、扫描期间的头部运动、头部大小或性别所驱动的。敏感性分析是在整个样本中进行的，使用独立的Spearman等级偏相关控制年龄加上每个潜在的混杂因素。当控制距离校正的TMS刺激强度时，路径纤维密度与左杏仁核TMS诱发反应幅度之间的关系仍然显著（rs.partial = 0.31, 95% CI = [0.004 to 0.56], P = 0.0461）以及TMS刺激部位在MNI Y和Z坐标中的位置（rs.partial = 0.39, 95% CI = [0.10 to 0.62], P = 0.0108）。这些观察结果支持TMS给药的个体化元素并不能解释这一发现。考虑到刺激部位是根据其与左杏仁核的静息态功能连接性选择的，我们验证了纤维密度与杏仁核诱发反应之间的关系不能归因于这种功能连接的强度之间的个体差异（rs.partial = 0.31, 95% CI = [0.01 to 0.56], P = 0.0398）。此外，我们还证明了在控制扩散扫描期间的头部运动（rs.partial = 0.36, 95% CI = [0.06 to 0.60], P = 0.0179）、spTMS/fMRI扫描期间的头部运动（rs.partial = 0.37, 95% CI = [0.08 to 0.61], P = 0.0139）、总颅内容积（rs.partial = 0.37, 95% CI = [0.08 to 0.61], P = 0.0142）或参与者性别（rs.partial = 0.37, 95% CI = [0.08 to 0.61], P = 0.0140）时，纤维密度与杏仁核诱发反应之间的关系不受影响。最后，我们验证了使用另一种方法进行杏仁核分割对我们的发现没有影响。当使用参与者FreeSurfer分割来识别杏仁核时，纤维密度与诱发反应幅度之间的关系是显著的（rs.partial = 0.36, 95% CI = [0.06 to 0.60], P = 0.0171），效应大小与使用哈佛牛津图谱获得的效应大小相等。

确定的路径与神经刺激诱导的皮层下反应有差异性关联

      我们已经证明了左杏仁核TMS诱发反应的幅度与所描述路径中的纤维密度有关，我们的目标是建立这种关系的特异性。因此，我们检查了左vlPFC-杏仁核路径纤维密度与其他皮层下结构中的spTMS/fMRI BOLD反应之间的关联。与观察到的杏仁核和海马TMS诱发反应相关的观察结果一致，更高的vlPFC-杏仁核路径纤维密度也与左海马的更大幅度诱发反应显著相关（rs.partial = 0.54, 95% CI = [0.28 to 0.72], PFDR = 0.0010）。然而，vlPFC-杏仁核路径纤维密度与左尾状核、伏核、苍白球、壳核或丘脑的诱发反应幅度没有关联（所有PFDR > 0.90），这表明路径对皮层下神经刺激诱导的大脑反应的影响具有很大的特异性。

当刺激一个远离的控制部位时，路径纤维密度与TMS诱发的杏仁核反应无关 

      在最后的分析中，我们研究了当TMS应用于第二个空间上远离的活动部位时，左vlPFC-杏仁核路径的纤维密度是否与左杏仁核TMS诱发反应幅度有关。用于这种路径控制分析的次要刺激部位位于杏仁核靶向刺激部位的背侧和后侧，平均位置为4.4（± 1.5）厘米（图4C）。次要刺激部位是为一个平行的、与临床相关的研究设计的，该研究评估了spTMS对皮层下前扣带皮质的下游效应——一个与TMS在抑郁症中的疗效相关的大脑区域（32, 34, 35）——因此，它们被选择是因为它们显示出与皮层下部分（而不是明确的最小杏仁核连接性）的强功能连接性。在这里，我们使用这些次要部位作为活动控制部位（即，被刺激的解剖学控制），以确定当刺激应用于vlPFC附近与远离vlPFC时，vlPFC-杏仁核路径对杏仁核TMS反应是否有可区分的效果。

      应用于次要活动部位的spTMS诱发了平均绝对值左杏仁核诱发反应为0.19% ± 0.25（45名参与者中有28名显示负诱发反应），这与临床发现相辅相成，即左背外侧TMS可以治疗以杏仁核功能障碍为特征的疾病，尽管疗效变化较大（15, 16, 19）。当刺激vlPFC时，62%的参与者左杏仁核诱发反应的绝对幅度比刺激这些活动控制部位时大（平均大0.15%），尽管这并不代表幅度上的统计学显著差异（V = 653, 95% CI = [−0.01 to 0.10], P = 0.1284）。我们没有确定杏仁核与这些次要活动TMS部位之间的结构连接（使用一个结合了所有参与者的皮层下靶向刺激部位的宽松组掩模），这表明背外侧TMS可能通过多突触连接影响杏仁核活动（10）。最后，我们假设，因为刺激空间上远离的活动控制部位不太可能直接参与左vlPFC-杏仁核路径，所以这条白质路径的微结构与控制部位TMS诱发的左杏仁核活动变化之间不会有关系。当TMS应用于活动控制部位时，vlPFC-杏仁核路径纤维密度与左杏仁核TMS诱发反应的幅度没有显著关联，因果支持路径特异性（Spearman部分相关，控制年龄：rs.partial = 0.09, 95% CI = [−0.22 to 0.38], P = 0.5729）（图4D）。

讨论： 

        相当一部分经历情绪、焦虑和与压力相关的精神疾病症状的个体对目前可用的治疗没有得到满意的临床反应，这需要修改或新的治疗方案。一个有前景的、基于实验性治疗的方法是识别能够与症状学紧密相关的大脑区域（目标）相互作用的干预措施，如杏仁核。TMS既是一种可以进一步优化的精神疾病治疗方法，也是（与fMRI结合时）一种用于测量目标参与度的工具。在本研究中，我们在健康参与者中应用交错的spTMS/fMRI来检查前额叶TMS对杏仁核的影响。我们的结果表明，施加在vlPFC内或附近的spTMS诱发了杏仁核fMRI BOLD信号的急性、刺激水平依赖性调节。我们还描述了一个与进化保守的白质路径，该路径连接vlPFC和杏仁核，有可能将TMS诱导的神经活动从受刺激的皮层表面传输到内侧颞叶。当刺激vlPFC时，识别出的路径中的较高纤维密度与杏仁核中TMS诱发的fMRI BOLD反应的较大幅度相关，但当刺激一个活动控制部位时则不是如此，这支持了这条路径在vlPFC到杏仁核TMS信号传导中的特定作用。总体而言，这个spTMS/fMRI探测和测量研究证明了TMS对杏仁核的参与，并进一步强调了促进这个皮层下目标参与的潜在机制。

      研究精神疾病治疗反应的神经基础的研究反复报道，抑郁、焦虑、强迫症和创伤后应激症状的减少与杏仁核活动的正常化同时发生（17、37、41-44）。治疗后观察到临床改善与修改后的杏仁核功能之间的关联，包括使用精神药物、认知行为疗法、电休克疗法和手术干预，这一致地表明，神经调节杏仁核可能有助于有效减少跨诊断的精神病理学。在这里，我们提供了神经调节相关的证据，表明应用于左前额叶-杏仁核功能连接峰值的TMS可以引起杏仁核fMRI活动的下游变化，产生的效果在杏仁核比在大多数皮层下区域都要大。特别是，我们的发现表明，当特定地应用于vlPFC时，非侵入性脑刺激可以参与杏仁核活动，这是一个参与情感调节的皮层区域，并且在与情感相关的精神病理学患者中跨诊断性地低活跃（11、14）。这是我们的初步研究的复制（22），并提供了进一步的基于大脑的证据，确定了与杏仁核有轴突投射的vlPFC领域作为情感、焦虑和压力障碍的候选TMS治疗目标。基于行为的证据证实了通过这一回路进行脑刺激的潜在效用，由两项独立的调查对vlPFC刺激提供。在第一次调查中，vlPFC TMS有助于健康个体调节和减少负面情绪（45）。在第二次调查中，前vlPFC的直接电刺激在抑郁症患者中产生了急性的情绪改善（46）。补充证据因此表明，vlPFC刺激可以影响多种精神疾病中被破坏的神经和临床特征。然而，值得注意的是，vlPFC不是唯一一个对于刺激为基础的杏仁核功能障碍治疗感兴趣的皮层区域。先前的工作已经显示，应用于额极（47）或背外侧（18、19）PFC的重复TMS与随后的杏仁核功能变化相关，而在这里，应用于背侧PFC部位的spTMS在某些个体中能够改变杏仁核BOLD信号。因此，应进一步探索ventrolateral、frontopolar和dorsolateral PFC区域对于杏仁核为目标的脑刺激在精神疾病中的相对优势。vlPFC的重要优势包括其在有意的情感调节和重新评估中的作用（5-11）、其对于TMS的可达性，以及其直接的结构路径到杏仁核，使得TMS效果明显和可靠的TMS定位。

      在这项研究中，应用于以vlPFC为中心的杏仁核靶向皮层部位的非侵入性脑刺激显著降低了杏仁核的BOLD信号，从而在总体水平上诱导了平均的负向诱发反应。TMS诱导的fMRI信号减少在基底外侧杏仁核中最为显著，其中包括参与恐惧条件反射、唤醒、评价和社交行为的核团（1-3）。考虑到fMRI指标中的杏仁核活动增加在精神疾病患者中是一致观察到的（11、13、14），这可能是TMS反应的临床首选方向。然而，增强杏仁核活动在某些情境下可能是有益的。例如，杏仁核神经元活动的增加是消除条件性恐惧所必需的（4、48、49）。尽管TMS脉冲在大多数参与者中降低了整体的杏仁核活动，但大约四分之一的研究样本确实经历了相当大的正向杏仁核诱发反应，为神经反应的变异性提供了证据，这种变异性可能扩展到TMS治疗反应的变异性。杏仁核诱发反应方向中的TMS变异性不能简单地用参与者特定的刺激部位属性来解释，因此可能归因于TMS所涉及的杏仁核神经元种群之间的个体差异。杏仁核包含兴奋性和抑制性神经元种群，其核团还可以相互兴奋和抑制。因此，有符号的TMS反应的方向可能取决于TMS诱导的动作电位传播到的精确的杏仁核微环路，以及基底外侧与中心内侧和表面细分参与的程度。TMS还可以根据该区域的当前活动状态对同一脑区产生相反的效果（26、50-53），这表明参与者之间的对比内源性脑状态也可能是杏仁核诱发反应方向的非均匀性的原因。

      不考虑功能反应的方向，我们的数据表明，在所有参与者中，vlPFC-杏仁核的白质通路对vlPFC TMS对杏仁核的神经调节起到了作用。因此，vlPFC到杏仁核的结构通路可能允许TMS由于直接去极化它们的轴突连接而同步地影响这两个区域的神经活动。这个vlPFC-杏仁核通路的直接调节的潜在重要性得到了精神病学中深部脑刺激(DBS)的报告的证实：当电极接触皮层-皮层下白质连接时，皮层下DBS在减少精神症状方面明显更有效(54-58)。这条通路的相关性进一步被发现，更高的通路纤维密度与更大的TMS诱导的fMRI活动调节相关联——但只在内侧颞叶皮质下结构中，且只在刺激vlPFC时。因此，我们的扩散MRI发现提供了体内证据，表明更大的白质传导性增强了TMS诱导的神经信号传输到远处脑区的能力，而白质连接性概况决定了信号传输的路径。白质在塑造TMS的下游反应中的中心作用突显了结构连接性被利用来有效和焦点地参与与精神病理学相关的皮质下结构的潜力，为基于扩散的TMS定位的价值提供了实证支持。

     迄今为止，皮层-皮层下静息态功能连接性已经成为用TMS靶向皮质下结构的主要测量方法，并在重性抑郁症的背景下显示出改善临床结果的前景(32, 34, 35, 59)。在临床相关任务中测量的功能连接性也被提议作为一种方法来识别连接性引导的TMS位点；这种方法在一个情感图片任务中被用来定位前额叶-杏仁核功能连接，以刺激重复TMS(47)。然而，对于给定的皮层下目标，皮层功能连接权重在同一个个体中随时间变化，影响TMS刺激位点选择的重复性(60)。结构连接性在时间上是稳定的——白质通路在儿童早期形成并在生命周期中保持——并且是从皮层到皮质下信号传播的基础物理基质。因此，扩散MRI可能补充或增强fMRI来指导TMS线圈的定位。例如，可以使用多模态方法来确定vlPFC的一个区域，该区域既与杏仁核稳固地结构连接，又在情感调节任务中与其功能连接。因此，结合结构和功能连接性的整合策略特别值得进一步研究。这些可个性化的、精确的连接组学策略最终可以被应用，不仅仅是增强TMS调节杏仁核的能力，还可以触及其他皮质下目标，这些目标对多种形式的精神病理学有所贡献。

      本研究必须在spTMS/fMRI和扩散MRI数据的采集和分析的传统限制的背景下进行考虑。由于目前没有商业上可用的模拟扫描TMS的声音和体感效应的sham TMS/fMRI线圈，因此本研究无法实施sham对照(26)。因此，我们不能排除TMS相关的感知或唤醒增加对观察到的amygdala fMRI BOLD效应的可能性。然而，我们期望，对于突出的显著性和唤醒，都会增加amygdala的活动——但大多数参与者表现出TMS诱导的amygdala fMRI BOLD信号的减少。未来的工作将从MR兼容的sham线圈或刺激活动控制的发展中受益，这些控制与杏仁核的功能连接最小。关于fMRI信号本身，TMS诱发的BOLD反应只是间接地指示神经元活动的变化，并且还可能受到新陈代谢、脑血管反应性和神经血管耦合变化的影响。对于我们的扩散MRI分析，所使用的白质纤维密度测量不是轴突数量的明确测量。然而，一个fixel内的轴突计数或包装密度的增加（或可能是细胞外空间的减少）将被反映为纤维密度的增加。此外，与所有tractography方法一样，我们不能确定在左vlPFC和左杏仁核之间确定的结构路径代表单突触还是多突触连接。另外两个限制代表了未来研究的关键途径。首先，本研究没有设计来解析正面与负面的amygdala TMS诱发反应是否预测了重复TMS的不同的行为或临床结果。未来的工作应该探索spTMS反应方向性与重复TMS诱导的恐惧条件、负面情感、价值评估或情感调节变化之间的关系。其次，我们使用了回顾性研究设计来检查vlPFC–amygdala白质通路特征与TMS诱发BOLD反应之间的关系。因此，TMS线圈并不总是精确地定位在通路的皮层纤维终点上（例如，对于更多的背侧定位的amygdala目标刺激位点），这可以在未来的前瞻性结构连接性为基础的靶向研究中纠正。

     本研究证明了spTMS/fMRI和扩散MRI可以共同利用，以检查皮层神经刺激如何影响与心理病理学的表现和治疗相关的大脑区域的活动。我们的发现强调了检查TMS的下游、皮质下效应的相关性，以及绘制这些效应背后的因果回路的重要性。回路绘图方法已经应用于DBS，以增加刺激方案的临床效果(54-58)，正如这里所示，可以将其转化为TMS，目的是为治疗方案提供信息。最终，将从spTMS/fMRI基于大脑的读出和基于扩散的连接中获得的见解整合到TMS方案中，可能有助于增加TMS对大脑活动和行为的影响——从而增强治疗性TMS对精神疾病的疗效。

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