二、肿瘤发展进程、全基因组突变发生顺序（The evolutionary history of 2,658 cancers）

分析工具及代码（Python & R）及原文链接

一、使用等位基因点突变追溯突变发生的时间

a. 方法原则：

早期突变（远期突变），因细胞分裂，相同点突变出现于等位基因上，每个肿瘤细胞都存在
晚期突变（近期突变），点突变只出现于等位基因其中之一，每个肿瘤细胞都存在
Clonal（克隆系），相同的点突变出现于等位基因上（属早期突变），或出现于扩增的等位基因上（肿瘤染色体可能为多倍体，介于早期晚期中间），每个肿瘤细胞都存在
Subclonal（亚克隆系），点突变只出现于等位基因其中之一（超晚/近期突变），非每个肿瘤细胞都存在

b. 肾癌肿瘤细胞数：早期突变 > Clonal(早中期突变) > 晚期突变 > Subclonal(超晚期突变)

c. 各个肿瘤类型中突变发生的时间，其中CNS-GBM的1、7、17、19、20号染色体中1号染色体早、中、晚期突变的概率相仿，而后四者以早期突变为主

d. 热图第一行显示CNS-GBM突变以7、17、19、20早期突变为主

e. 大多数重复突变（发生于不同染色体）的时间同步，较少重复突变发生的时间不同步

f. 同e，大多重复突变的时间同步（其中WGD为非二倍体，Near diploid为近二倍体）

g、h同e、f 大多肿瘤细胞为非二倍体（WGD）且重复突变发生的时间同步（即在某个点时间发生的多个染色体的重复突变，参考基因重复）

二、点突变追溯显示基因突变（不同形式的）以发生于早期为主

a. 22% early clonal, 7% late clonal, 53% unspecified clonal，17% subclonal

其中CNS-GBM以早、中期突变为主占比90%以上

b. 各个突变基因发生时间比值

如TP53早、中期突变：晚期突变约 9-10 : 1（即早、中期占90%以上）
而PTEN早、中期突变：晚期突变约 1 : 1 （即早、中期占50%）

c. TP53在各个肿瘤中突变发生时间比值

如CNS-GBM的TP53突变发生时间 早期：晚期 > 50 : 1 （即早期占98%以上）；Clonal ：Subclonal 约 1:1（即各50%）

d. 如图b，50%的早期突变集中于9个突变基因中，剩下50%的早期突变分散在其余的35个突变基因中

三、通过单个肿瘤样本追溯突变发生时间

a. 原理图

大致意思：一个肿瘤样本，有n个细胞，某基因，有n个序列(可同或不同)，按照图一a原则，进行权重排序，计算突变发生率，并推测其发生时间

b-d. 及 e-g. 具体例子关注图d.和g. CNS-GBM中（按发生早晚的时间顺序）

基因/染色体 突变	发生时间
EGFR、10号缺失、TP53、17号长臂缺失、9号长臂缺失、7号增加	发生于早期
IDH1、4号1区2带增加、TERT、20号长臂增加、WGD、8号短臂缺失、PTEN、姐妹染色体9号短臂2区1带3亚带缺失、19号短臂增加、7号短臂1区1带2亚带增加、姐妹染色体10号2区3带3亚带1次亚带缺失、RB1、1号短臂3区6带3亚带2次亚带缺失、20号长臂增加、15号长臂1区4带缺失	发生于中期
6号长臂缺失、14号长臂缺失、19号长臂增加、22号长臂缺失、11号短臂缺失、13号短臂缺失、11号长臂缺失	发生于晚期（近期）

四、早/晚期点突变类型

a. 皮肤黑色素瘤，紫外线（UV）导致早期点突变，且以 C > T为主（胞嘧啶突变为胸腺嘧啶）；不明原因导致晚期点突变以C > A为主（胞嘧啶突变为鸟嘌呤）

b. 乳腺癌情况

c.d. 不同致癌因素导致早/晚期突变的比例

紫外线（UV）以导致早期突变、clonal为主
载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC)以导致晚期突变、subclonal为主

五、早期突变（远期突变）距今时间推测

a. 根据分子时钟、基因倍增时间及最近共同祖先推测早期突变（远期突变）距今的时间

b. c. 不同肿瘤早期突变到目前的潜伏时间，其中GNS-GBM约2年

由于CpG岛高度保守，正常细胞与肿瘤细胞内CpG甲基化变为TpG的时间稳定，可以作为分子时钟
通过CpG > TpG的比例可以推测肿瘤细胞存活时间，结合肿瘤细胞测序结果，可推测早期突变距今的时间

六、典型的肿瘤突变基因及突变发生时间轴

a. b. c. d. 分别是直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌：早期（绿色），中期（蓝色），晚期（粉色），超晚期（粉色）

--------------------华丽的分割--------------------

附图一、直肠癌肿瘤发展进程、全基因组突变发生顺序概况

附图二、不同方法对突变进行时间追溯，结果基本一致

附图三、早期脑肿瘤细胞概况

a. CNS-GBM 7号染色体突变情况

二倍体，如为早期突变，则每个等位基因之一均含该突变，即等位基因变体占比(VAF)=0.5；低于0.5提示晚期突变，VAF越小，突变据目前越近
多倍体，会出现VAF>0.5的情况
7号染色体（3倍体），如为早期突变（多出的染色体必含有该突变），则VAF = (1+1)/3约 0.7，而实际VAF约0.3左右，提示为中晚期（近期）突变	

b. CNS-GBM 7号是否为3倍体的样本分布情况

CNS-GBM 7号为3倍体的样本，大多点突变位点数在10以下
而7号不为3倍体的样本，大多点突变位点数在1000以上
结果提示：7号染色体为三倍体，是一个分类的亚型

c. d. 髓母细胞瘤情况，涉及17号染色体长臂

附图四、图三方法的验证结果

附图五、两种模型（League model and Bradley–Terry model）结果基本一致

附图六、图四扩展举例

图b列2显示 CNS-GBM clonal（早中期突变）与cubclonal（晚期突变）点突变均以 C > T 突变为主

附图七、图一扩展举例

附图八、图五扩展举例

e. 年龄因素影响肺癌最小，影响胶质瘤最大
但该结果可能受样本量小，或肿瘤确诊时年龄分布范围狭窄（肺癌：40-60岁；胶质瘤：20-80岁）影响

附图九、同附图八

f. CNS-GBM（恶性）潜伏期（突变至肿瘤确诊时间）约2年，而CNS-少枝胶质细胞瘤（偏良性）潜伏期约4年
g. 显示CNS-GBM多表现为subclonal，及多发子突变集；而CNS-髓母表现为线状结构（少子突变集）

END