用Cufflinks计算差异表达

Cufflinks计算差异表达
Cufflinks包含了以下程序：

Cufflinks 使用经过Tophat比对好的SAM格式来拼接转录组（每一个样本都进行拼接），如果有基因组注释文件的话，效果会更好。这个步骤的目的在前面已经讲过，包括后面的cuffmerge，即为了更精确地确定转录组的所有转录本以及其所有的剪接变体，从而更精确的进行定量分析。
如果已经有了参考基因组和基因组注释文件，这个步骤和cuffmerge都可以跳过，也就是说
cuffquant/ cuffdiff 可以直接接受Tophat输出的文件进行定量分析，差别就是选项中的基因
组注释文件用你之前下载的基因组注释文件，而不是由cufflinks、cuffmerge生成的注释文
件，一般不推荐这么做。因为即使是研究比较深入的模式植物，每次转录组测序都会发现新
的转录本。

cuffmerge 将Cufflinks拼接的所有转录组整合起来
cuffquant v2.2.0 后出现的新功能，在之前的cuffmerge 和 cuffdiff 之间插入了一步，作用是计算每个样本的表达量（应该是raw count），产生一个中间文件，这个文件可以用cuffdiff 和cuffnorm分析，是一个可选步骤。
cuffdiff 可接受Tophat的输出/cuffquant的输出/或者跳过cuffquant
对每个处理都两两进行差异分析，分析哪些基因上调或者下调，显著性如何等，后面介绍。

cuffnorm 也是v2.2.0 后新出来的功能，不进行差异分析，只计算FPKM等值，进行标准化

下面脚本进行了从Cufflinks到cuffdiff的一个流程，绝大部分参数使用默认参数即可，其他参数请看官方手册，因为中间涉及几个不同程序，需要要搞清楚每个程序需要的输入文件和输出文件。

1.#运行Cufflinks，分别拼接每一个样本的转录组
2ls pwd |grep ‘gz’|while read filename
3do
4cufflinks -p 4 -o “./KaTeX parse error: Expected '}', got 'EOF' at end of input: …e%%.*}_clout" "{filename%%.}/accepted_hits.bam"
5done
6#创建一个 assemblies.txt
7#运行cuffmerge，将所有样本拼接好的转录组合成一个
8#参数 -g 添加基因组注释文件，可选
9#参数 -s 为参考基因组 fasta格式
10cuffmerge -g Teatree.gff3 -s Teatree_Assembly.fas -o ./cuffmerge_out/-p 4 assemblies.txt
11#运行 cuffquant
12ls pwd |grep ‘gz’|while read filename
13do
14cuffquant -p 4 -o "./cuffquant_result/KaTeX parse error: Expected '}', got 'EOF' at end of input: …t/merged.gtf "{filename%%.}/accepted_hits.bam”
15done

1#运行cuffdiff
1cuffdiff -p 4 -o ./cuffdiff_out -L T25_4h,T4_4h,T4_8h ./cuffmerge_out/merged.gtf
./cuffquant_result/SRR1747100-25du-4h-1_cqout/abundances.cxb
,./cuffquant_result/SRR1747101-25du-4h-2_cqout/abundances.cxb
./cuffquant_result/SRR1747102-4du-4h-1_cqout/abundances.cxb
,./cuffquant_result/SRR1747103-4du-4h-2_cqout/abundances.cxb
./cuffquant_result/SRR1747105-4du-8h-1_cqout/abundances.cxb
,./cuffquant_result/SRR1747107-4du-8h-2_cqout/abundances.cxb\