单细胞分析（17）—— RNA Velocity有关文件准备

如何获取 genome_annotation.gtf 和 repeat_mask.gtf 及确定 BAM 文件匹配的基因组版本

在单细胞分析（16）—— RNA Velocity 分析流程中提及了运行RNA Velocity的两个关键文件，genome_annotation.gtf和repeat_mask.gtf，

velocyto run -b filtered_feature_bc_matrix/barcodes.tsv \
             -o velocyto_output \
             -m /path/to/repeat_mask.gtf \
             /path/to/possorted_genome_bam.bam \
             /path/to/genome_annotation.gtf

其中：

• -b：指定细胞条形码文件
• -o：输出 .loom 文件的目录
• -m：可选的 repeat_mask.gtf 以屏蔽重复区域
• possorted_genome_bam.bam：Cell Ranger 生成的 BAM 文件
• genome_annotation.gtf：基因组 GTF 注释文件

关于genome_annotation.gtf和repeat_mask.gtf这两个文件的有关内容和下载如下。

🔹 GTF 文件的内容和用途

GTF（Gene Transfer Format）文件是用于基因组注释的标准格式，主要包含基因、转录本、外显子和其他功能元件的信息。它们用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析，如RNA velocity、基因表达定量和功能注释。

1. **genome_annotation.gtf**（基因组注释 GTF 文件）
   • 存储内容：基因坐标、转录本结构、外显子和内含子信息。
   • 用途：
     • 确定 RNA 片段的基因来源。
     • 计算spliced/unsplicedmRNA 比例。
     • 用于RNA velocity和转录本组装。
2. **repeat_mask.gtf**（重复序列屏蔽 GTF 文件）
   • 存储内容：基因组中的重复序列信息，如转座子和简单重复序列。
   • 用途：
     • 过滤掉低质量或误匹配的 reads。
     • 避免重复序列影响 RNA velocity 计算。
     • 确保数据分析的准确性，减少假阳性信号。

🔹 获取 genome_annotation.gtf（基因组注释 GTF 文件）

genome_annotation.gtf 是标准的基因组 GTF 文件，包含所有已知基因的 外显子（exon）信息，用于 Velocyto 计算 spliced 片段。

✅ 方法 1：从 GENCODE/Ensembl 下载

你可以从 GENCODE 或 Ensembl 下载 符合你物种的基因组 GTF 文件。

1️⃣ GENCODE 下载（推荐）

GENCODE 官网

• 人类 (GRCh38)：

wget ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_43/gencode.v43.annotation.gtf.gz
gunzip gencode.v43.annotation.gtf.gz

• 小鼠 (GRCm39)：

wget ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M32/gencode.vM32.annotation.gtf.gz
gunzip gencode.vM32.annotation.gtf.gz

2️⃣ Ensembl 下载

Ensembl FTP

wget ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-110/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.110.gtf.gz
gunzip Homo_sapiens.GRCh38.110.gtf.gz

💡 注意：

• Ensembl 的 GTF 文件格式与 GENCODE 类似，适用于大多数物种。
• 确保下载 与 BAM 文件匹配的参考基因组版本（如 GRCh38 或 GRCm39）。

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🔹 获取 repeat_mask.gtf（重复序列屏蔽 GTF 文件）

repeat_mask.gtf 主要用于过滤 重复序列（repeat elements），避免错误地归类 RNA velocity 数据。通常由 RepeatMasker 生成。

✅ 方法 1：从 UCSC Table Browser 下载（推荐）

1. 进入 UCSC Table Browser
2. 选择你的基因组版本（如 GRCh38/hg38）
3. 选择 Track: RepeatMasker
4. 选择 Output Format: GTF
5. **点击 “Get Output” 下载 **repeat_mask.gtf
   

✅ 方法 2：从 UCSC FTP 服务器下载

wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/database/rmsk.txt.gz
gunzip rmsk.txt.gz

然后转换为 GTF 格式：

cut -f 6-9,12,14,15,16,11 rmsk.txt | awk 'BEGIN{OFS="\t"} {print $1,"RepeatMasker","exon",$2,$3,".",$4,".","gene_id \""$5"\"; transcript_id \""$5"\";"}' > repeat_mask.gtf

✅ 方法 3：使用 RepeatMasker 生成

RepeatMasker -species human -gff genome.fa

然后提取 repeat_mask.gtf：

grep -v "#" genome.fa.out | awk '{print $5, "RepeatMasker", "exon", $6, $7, ".", $9, ".", "gene_id \"repeat_"$10"\"; transcript_id \"repeat_"$10"\";"}' > repeat_mask.gtf

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🔹 如何确定 BAM 文件的匹配基因组版本？

✅ 方法 1：使用 samtools 查看 BAM 头信息

samtools view -H your_file.bam | grep "@SQ"

示例输出：

@SQ SN:chr1  LN:248956422
@SQ SN:chr2  LN:242193529
...
@HD VN:1.6  SO:coordinate
@PG ID:STAR  PN:STAR  VN:2.7.10a
@CO Genome Reference: GRCh38.primary_assembly.genome.fa

关键点：

• @SQ：染色体信息，SN:chr1 等表示染色体编号。
• @CO Genome Reference（如果存在）：直接告诉你参考基因组名称，如 GRCh38.primary_assembly.genome.fa。

✅ 方法 2：使用 samtools idxstats 确认染色体名称

samtools idxstats your_file.bam

• chr1, chr2, chrX → UCSC 参考基因组（hg19/hg38）。
• 1, 2, X → Ensembl 参考基因组（GRCh37/GRCh38）。

✅ 方法 3：使用 bamtools 检查 BAM 头信息

bamtools header -in your_file.bam

如果 BAM 头中包含：

@CO Genome Reference: Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa

则说明该 BAM 文件使用的是 GRCh38 版本。

✅ 方法 4：检查 BAM 生成工具

samtools view -H your_file.bam | grep "@PG"

示例输出：

@PG ID:STAR PN:STAR VN:2.7.3a CL:STAR --genomeDir /path/to/genome_GRCh38

• --genomeDir 指向 GRCh38，则 BAM 参考基因组是 GRCh38。
• --genomeDir 指向 mm10，则 BAM 参考基因组是 小鼠 GRCm38。

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🔹 结论总结

文件	作用	推荐下载	备用方案
genome_annotation.gtf	提供基因注释（外显子信息）	GENCODE / Ensembl	手动提取 GTF
repeat_mask.gtf	屏蔽重复序列，避免错误归类	UCSC Table Browser	UCSC FTP / RepeatMasker

🚀 使用这些方法，就能正确获取 genome_annotation.gtf 和 repeat_mask.gtf，并确认 BAM 文件的基因组版本！ 🎉