序列分析……

转录组测序完成之后，转录组分析筛选出某些基因。

针对这些基因的分析……

首先，这条序列是不是全长？获得了全长的序列才有预测的意义。

复制关于此序列的所有核苷酸碱基，

到ncbi——BLAST——blastx （输入核苷酸序列查询氨基酸序列）

最上方的一条序列即与之最相近。

打开最相近的序列，

 这显示你所查询的序列第1位与目标序列的第56位对应上了，说明5'端（N端）缺少50个左右核苷酸，此序列不是全长序列。

通常来讲，转录组测序出来的序列全长可用于分析，不过我们一般进行验证全长后进行分析。

若没有验证全长的情况下，转录组测序得到的全长也可用于序列分析（相差无几）。

复制整段序列，在 ExPASy - Translate tool 网页内翻译氨基酸，把M、-  - 上方及M、-  -前一个氨基酸上方的6个左右核苷酸复制，在全长序列中查找，标出起始子和终止子。

eg：CSP

复制CSP全长序列，粘贴至下列网址

ExPASy - Translate tool

 -  - 代表终止子

把-  - 上方及-  -前一个氨基酸上方的6个左右核苷酸复制，在全长序列中查找，标出终止子。

（1）基因结构——外显子/内含子 

方法一、ncbi——blast——nucletide blast

复制粘贴包括起始子及终止子前后的UTR全部核苷酸序列，数据库选择wgs

 物种选择 Locusta migratoria (taxid:7004)

 blast   查询序列与基因组片段位置一一对应比较。

点击图谱选择最全的一条序列，将其他取消选择，然后点第三栏Alignment

点击图谱选择最全的一条序列，将其他取消选择，然后点第三栏Alignment
Sort by  Query start position
记录Query1 和Query最后1个对应的subject基因组序列位置（红色），看正向还是反向
右下角的**load next set**一定要点！！！否则序列不全！！！
选择ATG上游3000 TGA下游1000 bp左右 region下载
与自己基因序列**全长**（ATG - TGA）

方法二、飞蝗数据库 网址 LocustBase-Locust Genome data（康乐老师）

LocustBase——BLAST

选择locust genome数据库，basic search

将比对最好的基因组序列下载下来，包括FASTA格式以及带数字标记的序列（复制下来）。

打开Snapgene，把基因组序列粘贴，OK

 

再新建一个file，粘贴你的全长序列，保存这个.dna文件到桌面

接着打开全基因组的那个文件，在工具中，

 导入刚刚那个.dna文件，选中比对上的序列（只有基因组序列可选），然后，

 标记特征 eg: Exon1，可标记颜色等。

选中此段外显子即可获得外显子长度及位置信息，可开始AI 作基因结构图。

（2）核苷酸——氨基酸序列分析

复制 从起始密码子ATG到终止子

在ExPASY translate tool 中

此选项出来只有氨基酸序列

ExPASY translate tool ——Includes nucleotide sequences, no spaces——TRANSLATE!

复制5'-3' Frame1 粘贴到新建word（字体预设：Courier New）

开始——清除所有格式

全选——字体Courier New 字号7

手动对齐 一行60字符 （序列长，一行120字符；序列短，一行60字符），若是验证全长后的序列，前后加上转录组5',3'-UTR，未经验证的全长序列可不加5',3'-UTR，每行后标记加和字符数。

全选——右键——字体——全部大写字母

标记CSP序列保守区（4个典型Cys保守区）颜色  字体白色

起始，终止密码子字体红色

段落设置——取消如果定义了文档网格，则与网格对齐

加标注与标题（基因名称）

截图到PPT

信号肽预测 蛋白质信号肽预测 - 在线工具 - 纽普生物 - NovoPro
蛋白质理化特性 复制粘贴aa序列 ProtParam 获得理化特性相关信息

画氨基酸domain，aa domain预测

SMART: Main page

 预测信号肽位置及保守结构域的aa

根据上述，AI作图，氨基酸结构。

NCBI Conserved Domain Search  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi

多序列比对（后续2023 用Gendoc进行多序列比对更简单）

从起始密码子到终止密码子复制核苷酸序列，到ncbi——blast——blastx，查询匹配度高的氨基酸序列。 

FASTA  序列号

下载一些相似度较高的典型物种，比如同目不同种，不同目的aa序列。

比如：

直翅目：飞蝗、沙漠蝗虫、亚洲小车蝗、黄胫小车蝗、黄脊竹蝗

鞘翅目：赤拟谷盗

鳞翅目：家蚕

膜翅目：松毛虫赤眼蜂

双翅目：番石榴果实蝇、果蝇、冈比亚按蚊、埃及伊蚊

半翅目：稻绿椿

同翅目：扶桑绵粉蚧

先每个目多选几条序列大致比对，然后从中挑选序列，重新比对。

Multiple Sequence Alignment - CLUSTALW 

Multiple Sequence Alignment - CLUSTALW  https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw

复制3条以上aa序列，在clustalw中进行execute multiple alignment

下载 clustalw.aln 文件。

Expasy——swiss model

粘贴aa，search for template——build models  下载.pdb文件

网页——espript3.0

RUN ESPRIPT——Aligned file 选择文件.aln，下一个选择文件.pdb，Number of columns改成85（每行显示85个aa），color scheme选择B&W黑色，output format选 postscript file,PDFfile,TIFF image(600 dpi)，可指定顺序，Gap between blocks 3~5（4）——SUBMIT——下载TIFF文件。

多序列比对完成。AI修改。

 2023  多序列比对

 飞蝗和其他物种的序列保守性分析  aa序列相似度分析

Blastx  organism 限定物种 

飞蝗 赤拟谷盗 家蚕 冈比亚按蚊 果蝇 小菜蛾 灰飞虱 蚤状蚤 杨叶甲

棉蚜 桃蚜 玉米螟 草贪 蓟马

蜻蜓 蜜蜂 螳螂 七星瓢虫 赤眼小蜂

网柄菌 斑马鱼 人

GeneDoc - File - import .txt -done，

 

 多重序列比对图片导出，点击“Edit”-“Select Blocks for Copy”。

 然后再点击“Edit” -“Copy Select Blocks to”-“MetaFile”，即可直接复制得到多重序列比对的图片。

建树 MEGA软件使用

复制自己序列全长 ATG-TGA

ncbi——BLAST——blastx （输入核苷酸序列查询氨基酸序列），fasta格式（>），直接BLAST，查询匹配度高的氨基酸序列。 

玉米螟Ostrinia furnacalis、草贪Spodoptera frugiperda、棉铃虫Helicoverpa armigera、斜纹夜蛾Spodoptera litura、家蚕Bombyx mori、印度谷斑螟(Plodia interpunctella)、黑脉金斑蝶Danaus plexippus、棉红铃虫Pectinophora gossypiella、菜青虫Pieris rapae

、大蜡螟Galleria mellonella、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小菜蛾Plutella xylostella

再限定物种 找找其他物种如飞蝗、桃蚜、棉蚜。

下载Fasta格式 .txt

全部序列 放在一个txt中；另存为一份，更改物种-蛋白命名。

MEGA7.0 
1.打开软件

2.点工具栏中Align，点下拉菜单中“Edit/build alignment”,选择“Great a new alignment”——OK

在下一对话框中选择“protein”

复制更改命名的fasta格式的全部序列 eg 15条，ctrl+V.

比对后保存，Data——Export Alignment——MEGA Format.（.meg格式）

.meg格式文件拖入MEGA软件框内，构树——Neighbor-Joining Tree

Test of phylogeny选择步长检验Bootstrap method，No. of Bootstrap Replications选择1000；

Model/Method选择p-distance；

Gaps/Missing Data Treatment 选择 Partial deletion, 50。

Bootstrap concensus tree是经过1000自展值综合考量后的发育树。

保存 .mtsx  

更改树的形状。 

3.打开.mtsx格式的文件，复制聚类树，粘贴在PPT中。

在PPT中全选，取消组合，更改斜体。

图片另存为.png。

找启动子

打开JASPAR

选择insecta数据库，输入CncC，search;

选中搜到的序列，点开scan，输入下游基因的fasta格式(>)，Relative profile score threshold默认80%，scan；

+链直接复制标记在上2000下500 word中标记，-链反向互补后在上2000下500标记； 

这种结合位点分析方法灵敏度很高，在大多数情况下能检测到有功能的结合位点。但是，大多预测的位点虽在体外（in vitro）能与TF结合，在体内（in vivo）可能并无功能，预测结果仍需做进一步的验证。

对于研究较多的明星基因，ncbi搜基因名，点开基因图谱——tools——sequences text view——annotated选none，粉色代表外显子，绿色代表内含子，紫色代表5',3'-UTR区，白色代表两个基因之间的间隔。

promoter区扩增：选取5'-UTR附近的区域至ATG下游200bp左右进行引物设计

输入全长序列，search

在设计的引物前加上酶切位点和保护碱基

基因组（邢嘉乐d4高）为模板进行普通PCR——UGT392A1 promotor全长。

胶回收连接转化送测序，提质粒UGT392A1 promotor-T3-transT1。

双酶切，连pGL3.0载体，①UGT392A1 promotor-pGL3.0-transT1。无内毒素提质粒。

②CncC-pIEX4-transT1过表达体系，无内毒素提质粒。

①②共转染细胞。

原核表达：

1）网页设计引物

2）snapgene检查是否编码正确氨基酸：

新建 ATG-去除信号肽-去掉终止子序列，前后加上6位酶切位点，保存为9A；

打开载体序列，

选择载体酶切位点（大片段），插入片段选择加酶切位点的序列及酶切位点，与 载体酶切位点顺序一致，clone，保存为pET28a-9A。

从前面的酶切位点开始检查，氨基酸翻译是否正确。

原核表达同源重组引物

https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html

载体序列方向不在意，只要5' 3' 接壤的酶切位点选择正确，就没问题。

Snapgene中，EcoR1和Hind3这种酶切位点碱基整体保留，只delete中间的碱基，然后插入自己的片段，看翻译是否正确。 

lncRNA必知必会的数据库资源大全 - 曾健明的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/357635131