RNA-Seq 笔记 [3]

这周主要内容是学习转录组的比对，选择的软件为hisat2，该笔记仅供个人参考谨慎搬运代码。

# hisat2 可以快速准确地将测序得到的 RNA 片段（reads）比对到参考基因组，从而确定这些RNA 片段在基因组上的精确位置，进一步可以用于基因表达量定量，剪接位点的检测等多种 RNA-Seq分析任务

#安装hisat2
conda install -c bioconda hisat2
#检查是否安装成功
hisat2 --help

① 建立索引

hisat2 需要一个 index 索引才能进行比对，hisat2 提供了一些 index，但很少，只有人类、小鼠等基因组的，我们研究梨的，所以就需要自己建立索引，使用的是DG参考基因组序列，前面已经下载好了，使用下列命令建立索引。

# 把下方的文件比对到索引上
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 2133867146 Jan 20 15:58 DG5_1_R1_val_1.fq.gz

#如何构建索引？查了不少资料解决了

# 技能树视频里面构建索引部分直接跳过了，走了一个小时弯路QAQ、
# 先把底下两个文件上传到我们的linux服务器，然后rename一下，尾缀是什么并不重要

# 重命名后运行如下代码，自己构建索引
hisat2-build dananguo_genome.fa genome

# 下面是走到一些弯路，从弯路里面提取点有用的

# 将fastq文件转化为fasta文件
wget http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/fastx_toolkit_0.0.13_binaries_Linux_2.6_amd64.tar.bz2
tar xjvf fastx_toolkit_0.0.13_binaries_Linux_2.6_amd64.tar.bz2
fastx_toolkit --help
fastq_to_fasta -Q33 -i 输入.fq -o 输出.fa

# 索引构建完成后，出现 8 个以 ht2为拓展名的文件👇

(py2env) [yinwen@node hisat2]$ ls -l
total 765852
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 174481544 Jan 27 16:29 genome.1.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 127714808 Jan 27 16:29 genome.2.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen       287 Jan 27 16:18 genome.3.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 127714802 Jan 27 16:18 genome.4.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 224243805 Jan 27 16:31 genome.5.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen 130051792 Jan 27 16:31 genome.6.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen        12 Jan 27 16:18 genome.7.ht2
-rw-rw-r-- 1 yinwen yinwen         8 Jan 27 16:18 genome.8.ht2

② 进行比对

# 注意-x 后跟索引文件，不加拓展名，保证 ht2 文件和 fa 文件的文件名一致即可
hisat2 -x genome -p 5 -1 /home/yinwen/clean/DG5_1_R1_val_1.fq -2 /home/yinwen/clean/DG5_1_R2_val_2.fq -S genome.sam
#运行后得到.sam文件

成功了！分析一下（成就感max）

① 总共有22937356个读取序列；

② 所有读取序列中 100.00%都成对存在；

③ 成对端序列中 24.64%的序列没有成功比对到基因组上；

④ 63.30%的序列只比对到了基因组上的一个位置；

⑤ 12.06%的序列比对到了基因组上的多个位置；

⑥ 对于没有成功比对的成对端序列，有 64.74%的序列不一致地（非正确配对的）比对到了基因组上一个位置；

⑦ 有的序列无法一致地或不一致地比对，这些序列占所有没有成功比对的成对端序列的 1992944对，它们一共包含3985888 个“pairs”序列；

⑧ 在这些“pairs”序列中：

• 40.37%的序列没有比对到任何地方

• 55.11%的序列比对到了基因组上的一个位置

• 4.52%的序列比对到了基因组上的多个位置

整体上的比对成功率为 96.49%（满足比对率基本都85%甚至90%以上）