抑制剧毒弧菌的新型噬菌体被发现

派森诺与江苏省农业科学院合作，在海洋与淡水生物学领域的《Aquaculture》发表研究成果！本研究在大黄鱼（Larimichthys crocea）中发现噬菌体vB_VhaS_PcB-1G能有效预防(93.33%)和控制(86.67%)V. harveyi弧菌感染。噬菌体的抗菌作用表明，该菌种有可能作为一种抗菌剂用于控制大黄鱼的V. harveyi弧菌感染和水产养殖中的弧菌病。

1、研究背景

大黄鱼(Larimichthys crocea，LC)和黄花鱼(Larimichthys polyactis)是中国沿海重要的生态和商业物种。近年来，随着养殖规模的不断扩大，养殖密度急剧增加，以及水污染和环境污染的影响，造成鱼类疾病经常发生。其中弧菌病是水产养殖中最严重的细菌性病害，对LC养殖业造成巨大威胁和经济损失。弧菌种类占海洋环境中可培养异养细菌的很大一部分，V. harveyi、溶藻弧菌和副溶血性弧菌与鱼类疾病相关。由V. harveyi弧菌和溶藻弧菌引起的弧菌病在中国养殖区爆发导致水产品在相对较短的时间内大量死亡。虽然化学治疗是一种快速有效的治疗或预防细菌感染的方法，但化学药物的频繁使用导致了细菌耐药菌株的产生。由于抗生素残留对人类健康和环境构成威胁，一些国家已禁止使用抗生素，所以水产养殖业需要新的替代的控制方法，以降低死亡率并尽量减少对人类健康和环境的影响。因此，噬菌体作为一种抗菌剂越来越受到人们的重视。本研究从LC中分离和鉴定了新的V. harveyi弧菌噬菌体，并确定了其宿主范围和基因组信息。大黄鱼体内感染实验证实了噬菌体的抗菌作用，此研究结果可为水产养殖中弧菌病的防治提供参考。

2、研究材料与方法

2.1实验材料：从福建省宁德市LC感染的肠、胰、肝、中肾等组织中分离到V. harveyi病毒54株；

2.2 测序平台：Illumina HiSeq

2.3 分析内容：噬菌体基因组测序、药敏实验、毒力基因分析、噬菌体形态学鉴定、宿主范围鉴定等。

3、研究结果

3.1 药敏实验

从大黄鱼中分离到54株V. harveyi弧菌，选择β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类、四环素类、多肽类、利福霉素类、头孢菌素类等13种抗生素进行药敏试验。此外，54株V. harveyi弧菌对多粘菌素E、阿莫西林、磺胺甲恶唑、氨苄西林、四环素和庆大霉素耐药。大多数菌株对头孢噻肟(96.2%，52/54)、阿米卡星(92.6%，50/54)和链霉素(92.6%，50/54)产生耐药性。部分分离株对恩诺沙星(88.9%，48/54)、卡那霉素(87.1%，47/54)、环丙沙星(51.9%，28/54)和利福平(72.2%，39/54)耐药(图1)。同样，所有分离株对氨苄青霉素均表现出较强的耐药性。值得注意的是，该菌株对利福平、阿莫西林、链霉素、卡那霉素、氨苄西林、环丙沙星、恩诺沙星和头孢噻肟也存在中度耐药；少数菌株对利福平和环丙沙星敏感。所有V. harveyi弧菌分离株均对至少9种抗生素表现出多重抗生素耐药性，94.4%(51/54)对10种药物耐药，85.2%(46/54)对11种药物耐药，64.8%(35/ 54)对12种药物耐药，37.0%(20/54)对本研究选择的13种药物耐药(图1)。

图1 54株V. Harveyi弧菌对抗生素耐药性的频率

3.2 抗性基因检测

54株V. Harveyi弧菌的抗性基因检测结果见图2。四环素耐药基因tetA最常见，检出率为81.5%(44/54)，其次为氨基糖苷aac(6′)-Ib和sulsulamine耐药基因sul2/sul1分别为13.0%(7/54)和9.3%(5/54)；广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因mecA和喹诺酮类药物耐药基因oqxA携带频率分别为7.4%(4/54)；大环内酯类耐药基因ermA和ermC的出现频率为9.3%(5/54)；87.0%的分离株至少携带1个抗性基因，4株分离株同时携带5个ARGs。

图2 V. Harveyi弧菌耐药基因的频率。

3.3 毒力因子分析

为研究分离株的致病性，分别对毒力相关基因(toxR和toxS)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、溶血素基因(vhhA和vhhB)，调控相关基因(luxR)、锌蛋白酶基因(pap6)和鞭毛结构基因(flaA)进行了验证。结果如图3所示,其中toxR是最常见的基因，检出率为75.9%(41/54)，其次是luxR(74.1%，40/54)、vhhB(74.1%，40/54)、vhhA(64.8%，35/54)、toxS(3.7%，2/54)和f1aA(3.7%，2/54)，VhpA、vhpB和pap6在所有分离株中均未检出。59.3%的分离株携带4种毒力基因，其中2株携带5种毒力基因。

图3 V. harveyi分离株中毒力基因的频率。

3.4 噬菌体分离与鉴定

从中国东海采集大黄鱼肉，从V. harveyi弧菌Vh-46菌株中分离得到感染的V. harveyi弧菌噬菌体，此噬菌体是一种新的噬菌体vB_VhaS_PcB-1G(此后命名为PcB-1G)。电子显微镜显示，PcB-1G具有125 nm长的尾巴和68 nm的距衣壳等(图4)。根据国际病毒分类，PcB-1G被归为Siphoviridae科。

图4 噬菌体vB_VhaM_PcB-1G的电子显微照片

3.5 宿主范围确定和一步增长曲线

噬菌体PcB-1G具有较短的潜伏期(_{10分钟)和较高的爆发量(} 210 PFU/Cell−1)(图5)。利用V. harveyi弧菌分离物测定噬菌体PcB-1G的抑制活性，结果显示61%(33/54)的V. harveyi弧菌分离株能被噬菌体PcB-1G抑制。培养48h后，噬菌体斑点中未发现寄主克隆，说明噬菌体具有较强的溶解能力。

图5 噬菌体vB_VhaM_PcB-1G与宿主Vh-46在37◦C的一步生长曲线。

3.6 体外噬菌体裂解能力

用噬菌体PcB-1G在MOI为10时处理Vh-46后，测定其生长曲线(图6)。对于Vh-46菌株，噬菌体PcB-1G对细菌生长的抑制作用高于对照。处理5 h后，Vh-46的OD值下降至0.09；Vh-46发酵液对照的OD值增加到2.0。在较低的MOI(10)下，噬菌体PcB-1G使细菌的生长速度下降，表明噬菌体PcB-1G在体外对Vh-46菌株的作用更有效。

图6所示。Vh-46被噬菌体vB_VhaM_PcB-1G在moi10和以Vh-462216E培养基为对照，以光密度为指示剂作用5 h时的生长曲线。

3.7 DNA提取和全基因组测序

对分离的噬菌体进行基因组DNA高通量测序，并对其进行基因组组装和注释，分析显示，噬菌体PcB-1G基因组为48,719 bp的双链DNA，具有80个orf， GC含量43.06%。比较分析发现PcB-1G的orf与一些噬菌体弧菌具有同源性（图7）。噬菌体PcB-1G基因组中未检测到rRNA、tRNA、抗生素耐药性、溶源性和毒力基因。NR预测到26个orf，而67.5%基因的是PcB-1G独有的且没有注释到功能的。其中3个orf与包括噬菌体弧菌在内的其他噬菌体的基因组具有高度的同源性，但其功能是位置的；9种假设蛋白质与其他菌种的噬菌体具有低同源性，包括假交替单胞菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、希瓦氏噬菌体和链霉菌噬菌体；其余54个orf与任何已知基因序列的同源性都很低。综上所述，噬菌体PcB-1G是一种新型可以裂解V. Harveyi弧菌的噬菌体。

图7 V. harveyi弧菌vB_VhaM_PcB-1G基因组

4、研究结论

本研究从LC培养区共鉴定出54株V. harveyi弧菌，94.4%(51/54)的V. harveyi弧菌分离株对10种抗菌素具有耐药性。V. harveyi弧菌的主要毒力因子是细胞外蛋白酶、外膜蛋白、溶血素、酯酶、磷脂酶、外毒素等相关基因。其中ToxR的频率高达75.9%，63%的菌株携带至少4种毒力基因。研究证明，噬菌体PcB-1G减轻了V. harveyi弧菌感染的可能性。因此对于养殖的LC，需要考虑使噬菌体PcB-1G在水中发挥的作用，以达到对弧菌有效的预防。