获取Unique reads方法

Unique reads

在NGS数据中，Unique reads指的是只能map到一个位置的reads。要判断一条read是否unique，需要看SAM文件的optional fields。optional fields的格式是TAG:TYPE:VALUE，在SAM文件的第12列。多个optionalfields由空格分开。与unique read相关的主要TAG是“NH”，代表一条read贴在了基因组的多少个位置，数据类型为i，即整数，所以"NH:i:1"就代表此条read只贴到了基因组上的一个位置。（但align的目标未必总是基因组，也有可能是转录组，小RNA组等，取决于实验设计。）以"X"(或"Y",“Z”)开头的TAG是保留给用户的。如tophat结果的“XS:A:+”就代表产生这条reads的来源是正链转录本，“XS:A:-”则是负链转录本来源。BWA的结果比Tophat(hisat2)的结果在mapping信息上更为详细。在BWA结果中，“X0"代表打开gap的个数(BWA不支持splicejunction，但支持gap)，数据类型为i。“XT"代表mapping类型，数据类型为"A”，即可打印字符，其值可以是Unique/Repeat/N/Mate-sw，有"XT:A:U"就代表这一条是unique read。由于BWA还提供了"AS”(alignment score)和"XS"(suboptimalalignment score)这两项，所以即使有些reads没有被Uniquely mapped，只要AS的值和XS的值相差足够大，也有一定价值。

注：
1、Sam文件各标签含义（tophat/hisat2）

•NH:i:: N=1时 为unique。常用于tophat/hisat2产生的sam文件unique read筛选。

•CC:Z: 当为‘=’为map到同一条基因上，一般在map基因组时由于内含子存在而容易出现，他只代表两种不同的方式，计数时应记为1。此处一般为其他基因的名字。CP:i 和HI：i标签为map到第i条基因及起始位置。

•YT:Z::代表的含义与bowtie产生的sam也不同。具体还未知！其他标签AS，XN,XM,XO,XG,NM,MD等如下图可以看出都相同。

•对于tophat/hisat2比对产生的sam文件我们可以直接筛选NH标签。

grep ‘NH:i:1’ out.sam >unique.sam

2、Sam文件各标签含义（bowtie2）

•AS:i:Alignmentscore.可以为负的，在local下可以为正的。 只有当Align≥1 time才出现

•XS:i:Alignmentscorefor second-best alignment. 当Align>1 time出现

•YS:i:Alignmentscorefor opposite mate in the paired-end alignment. 当该read是双末端测序中的另一条时出现
•XN:i:Thenumber of ambiguous bases in the reference covering this alignment.（推测是指不知道错配发生在哪个位置，推测是针对于插入和缺失，待查证）

•XM:i:错配碱基的数目

•XO:i:Thenumberof gap opens(针对于比对中的插入和缺失)

•XG:i:Thenumberof gap extensions(针对于比对中的插入和缺失延伸数目)

•NM:i:Theeditdistance。（edits:插入/缺失/替换数目)

•YF:Z:该reads被过滤掉的原因。可能为LN(错配数太多，待查证)、NS(read中包含N或者．)、SC(match bonus低于设定的阈值)、QC(failing quality control，待证)

•YT:Z:值为UU表示不是pair中一部分、CP是pair且可以完美匹配、DP是pair但不能很好的匹配、UP是pair但是无法比对到参考序列上。

•MD:Z:比对上的错配碱基的字符串表示。

由于bowtie2产生的sam文件并没有NH标签，所以提取uniqueread可能比较麻烦。首先提取“AS”标签表示能比对上的read（>=1 time），然后利用grep反正则表达式过滤掉XS标签得到我们需要的unique read。

grep “AS:” aligned.sam | grep –v“XS:” >unique_alignments.sam

对于双端测序用bowtie2比对筛选unique concordant pair时则需要在上一步的基础上增加如下命令：

grep ‘YT:Z:CP’ unique.sam>pair-end_unique.sam

3、Bwa获取unique

samtools view bwa.bam | grep “XT:A:U”