SMRT single molecular real time Sequencing

SMRT single molecular real time Sequencing
PacBio RS   RS 表示 Real time Sequencing
4 月 18 日技术讲座第三代单分子测序 PacBio 技术及其应用进展 
单分子测序的关键之一DNA 聚合酶
基本原理DNA 聚合酶和模板结合4 色荧光标记 4 种碱基经过 Watson 配对后不同的碱
基加入会发出不同光根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。这个 DNA 聚合酶是
实现超长读长的关键之一读长主要跟酶的活性保持有关主要受激光对它的损伤的影响。
PacBio 还在不断优化聚合酶的性能比如给聚合酶加上免受激光影响的保护基团等进一
步地提高读长提高测序质量和通量。
和其他基本测序技术一样在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应怎样在其中
进行单分子反应检测周围有大量的荧光标记的游离碱基怎样将反应信号与周围游离碱基
的强大荧光背景区别出来
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通过一个物理现象解释ZMWzero-mode waveguides零模波导孔。例如微波炉壁
上可看到有很多密集的小孔。小孔直径有考究如果直径大于微波波长能量就会穿透面板
泄露。如果孔径小于波长能量不会辐射外部可起保护作用。
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同理在一个反应管SMRTCell单分子实时反应孔中有许多这样的圆形纳米小孔
即 ZMW零模波导孔外径 100 多纳米比检测激光波长小数百纳米激光从底部打
上去后不能穿透小孔进入上方溶液区能量被限制在一个小范围体积 20X 10-21 L里
正好足够覆盖需要检测的部分使得信号仅来自这个小反应区域孔外过多游离核苷酸单体
依然留在黑暗中将背景降到最低。
单个 ZMW 底部固定有一个结合了模板 DNA 的聚合酶当加入测序反应试剂后每个
碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。一个 SMRTCell 中有 15 万个 ZMW每个孔中有
一个单分子 DNA 链在高速合成如众星闪烁。原始检测数据的结果每合成一个碱基即显
示为一个脉冲峰每分钟>100 个碱基的速度配上高分辨率的光学检测系统就能实时检
进行检测。
关键点之二荧光标记位点。这是影响测序长度的非常关键的因素。
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二代测序都标记在 5‘端甲基上在合成过程中荧光标记物保留在 DNA 链上随 DNA
链的延伸会产生三维空间阻力导致 DNA 链延长到一定程度后会出现错读。这是 NGS 的测
序读长仅能达到 100 多 bp 到 200bp 的一个原因。
PacBio 平台的碱基荧光标记在 3‘端磷酸键。在 DNA 合成过程中正确的碱基进入时
在 3’端磷酸键的标记是会随磷酸键断裂自动被打断标记物被弃去亦即合成的 DNA 链
不带荧光标记和天然的 DNA 链合成产物一致可以达到很长的读长。
笔者疑问是不是 NGS 改用 5‘端标记就能实现延长读长
答首先荧光标记在 3‘端磷酸键是 PacBio 的专利。其它公司没法做。荧光标记位点仅
仅是影响读长的一个重要因素之一PacBio 的单分子实时测序反应是最接近天然状态的聚
合酶反应体系最大限度地保持了聚合酶的活性。NGS 测序反应原理不尽相同有的是焦
磷酸测序反应除聚合酶外有多种酶参与测序反应 要兼顾多种酶的活力并容非一件易的
事有的是通过添加保护基团来控制碱基的加入和检测通过淬灭试剂来消除背景荧光和保

护基团这些都增加了测序反应体系本身的复杂性此外NGS 每加入一种碱基或一个碱
基后都需要清洗步骤清除没有反应的多余反应物及反应产生的次级产物这都影响了聚合酶
的合成进程。
关键点之三时空段概念
合成过程中每次进入一个碱基原始数据会实时地产生一个脉冲峰每两个相邻的脉
冲峰之间有一定的距离也就是有一个时间段的概念。这个距离的长短与模板上碱基是否存
在修饰有关如果有碱基修饰就像开车经过路障时通过速度会减慢导致两个相邻峰之
间距离加大。根据这个距离的变化可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰并且结果是
实时的。甲基化就是一种主要的碱基修饰PacBio 技术不仅可以提供序列信息还可提供
实时信息了解模板修饰的情况用于甲基化等碱基修饰研究。
二 测序流程和策略
配件SMRT cell chip小拇指指甲盖大小。一条 strip 可以放 8 个 SMRT cell仪器一次可
运行 2 条 strip共 16 个 SMRT cell
文库构建试剂盒测序试剂盒
流程和策略
1. 文库制备
材料全基因组 DNA或者 cDNA或者目标扩增产物
片段化全基因组太大需要片段化因为测序读长很长可以做很大的片段文库3-10kb
连接先把片段粘末端变成平端两端分别连接环状单链单链两端分别与双链正负链连接
上得到一个类似哑铃“套马环”的结构称为 SMRT Bell。连接半小时内完成。问题
片段化用什么方法两端的环状单链是同一序列吗如何确定单链方向如果两端一样如
何分辨正负链如何排除其他连接产物连接效率有多高如何纯化去掉酶答关于以上
文库制备问题跟 NGS 类似比如用片段化仪进行片段化加接头等等。通过优化的实验
protocol 进行各步骤的优化。 