测序技术的一些原理理解（sanger测序与illumina测序）

sanger测序 sanger是第一代测序，它是使用的链终止法。下面我来说说我的理解。 当你拿到你需要测定的测序后（一般sanger测序为几百bp），

• 首先，加热变性使双螺旋解螺旋，然后将引物结合到一条链上，如图：

 

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• 将结合了引物的序列等量放入4个反应体系中，然后将dna聚合酶和dNTPs加入各个反应体系中；
• 下一步，也是最关键的一步，在四个不同的反应体系中分别加入A,T,C,G四种带荧光标记的3'端被去OH的ddNTP，将体系混合（用来终止各个反应）
• 将反应结束的四个体系进行电泳（这种电泳的精度很高，可以精确到1个bp），然后就可以根据结果来进行来确定dna序列的碱基序列（越轻的dna片段跑得越快，所以从下往上读）

 

不知道为什么，一个很简单的原理，网上很多地方都写的异常复杂，百度百科也是.....

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illumina测序 illumina是二代测序的“代表人物”，下面讲一讲PE测序（双末端测序）的原理。 首先要知道一些二代测序的一些基本概念：在一个flowcell上一般有2个或者8个line，每个line被分成两列，每列大概有60个tile，而tile是荧光扫描时的最小单位，每个tile在每次循环的时候会被扫描4次，A,T,C,G各一次，下面讲具体过程：

将基因组切割成几百bp的小片段，然后用酶将不齐的末端对齐，之后在3'端加上一个碱基A，之后加上adapter，有两个点需要注意，一是文库中间的基因序是不同的，二是两端的接头是已知的。 此时，最好来一张图帮助理解：

接头的组成如上图所示。

在flowcell上面也有p5和p7接头，值得注意的是，他们是以共价键与flowcell相结合的。将已经接上接头的序列放到flowcell中，加入dna聚合酶和dNTPS，进行合成，反应完成之后，加入碱性溶液，使双链解旋。然后用水冲洗，中和碱性溶液，进行桥氏扩增，这样一直重复，最后使用化学反应去掉一个接头的所有序列，在板子上只留下一种类型的序列，然后加引物，加dna聚合酶，加带有不同荧光标记的NTP，同时他们的3'端具有使用illumina公司特定的方式进行了化学修饰，无法形成磷酸二酯键。所以在结合之后，用水洗掉多余的NTP和dna聚合酶，然后将板子用仪器来检测荧光，不同根据不同的荧光来确定序列上的碱基。一个循环结束，之后再加入特意处理的NTPs和dna聚合酶进行下一次反应。

一个板子有多个line，有上亿个接头，所以可以同时测定大量序列。 为了区分来自不同的sample，在adapter中的特定的地方加上一个特定的序列，叫做index（也叫barcode）。