CTAB法提取DNA的原理及步骤:
冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB 。
1.研磨
2.加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复)
预处理液:Tris-hcl (PH8.0)提供缓冲环境,防止核酸被破坏。
EDTA (螯合二价阳离子)0.5M抑制DNase活性。
Nacl 5M提供高盐环境,使DNA充分溶解。
β-巯基乙醇抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成络合物,也可与糖结合。
3.加800ul2×CTBA(预热),10ul β-巯基乙醇,65℃水浴1-2h。15min 震荡
4.冷至室温,离心1000r ,10min ,取上清750ul,加800ul氯仿-异戊醇(24:1),抽提10min,1000r,15min,重复3次。
氯仿:加速有机相与水相分层,去除核酸溶液中残余酚,抽提蛋白质等杂质。
5.取上清,加2倍体积的无水乙醇,-20℃,1h,沉淀DNA.
无水乙醇:DNA不溶于酒精,CTAB和一些蛋白质可以,低温乙醇可抑制DNase 活性,降低分子运动,易于DNA沉淀。
6. 4℃,1000r,10min,倒乙醇,收集DNA.
7. 70%乙醇洗涤2遍,风干(不可太干),溶于40-60ul dd水。
DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此能以同样的速率向正极移动。