甲基化系列 2. 甲基化芯片数据介绍与下载（GEO）

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公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.

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这期介绍一下GEO数据库中的甲基化芯片，方便大家进行数据集的选择和下载，进一步增加使用效率！

GEO甲基化数据下载

关于GEO数据介绍我们在RNA系列教程有介绍过，有需求的老师可以在看一次，这里就介绍甲基化数据，官网下载方式是相同的，通过GEOquery下载也可以，但是由于网络的问题总是下载失败，接下来就说说数据下载的不同方式，包括网页下载和GEOquery下载。

1. 网页下载方式

GEO主页链接如下：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

GEO主页进入之后页面右上方输入需要的数据集 “Keyword or GEO Accession” ，这里我们选择 数据集 GSE68379， 如下：

进入到对应数据集 GSE68379 网页中，可以看到数据集的相关信息，有Status,Title, Organism, Experiment type, Summary, Overall design等相关信息，在Summary我们可以清晰的看到样本信息，这里11215 tumors ,29个组织，1001癌症的细胞系，数据量还是很大的这篇文章发表在Cell上，无论是数据量还是工作量都非常大。

在看数据集的甲基化检测平台（Platforms）为甲基化芯片的450K，样本（Samples）为1028个，我们下载时需要根据自己的需求下载数据，由于芯片的原始数据一般都是非常大的，大概都是几个G以上的数据量，在我们自己下载的时候往往经常出现中断的情况，这样我们需要更好的办法来处理这个问题，比如翻个墙啥的，或者借助国内的一些公司都有整理这些数据，在他们的网页上下载也是可以的。

若我们并不需要全部的样本，可以考虑单个样本下载，在Samples里面找到自己想要研究的样本名比如 GSM1669567，点击该样本GSM1669567。

进入这个样本GSM1669567的页面，该页面有详细的样本信息介绍，比如我们选择的是细胞系 42-MG-BA，原发胃癌甲基化检测450K，如下：

单个样本的下载数据量还算小些，这样直接下载就可以了，这里需要说一下IDAT这种文件类型。

点击ftp下载即可，如下：

上期我们有简单介绍过甲基化芯片检测的原理，这期我们在详细介绍其甲基化水平定量的方法。

1、芯片：一张芯片包括12个array（如图显示），也就是一张芯片可以做12个sample，一台机子一次可以跑8张芯片，也就是一共96个sample，每个样本可以测到超过450，000个CpG位点的甲基化信息（大概人所有的1%，但是覆盖了多数CpG岛和启动子区），芯片本身包含一些控制探针可以做质控。
2、原理：简而言之，基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测。亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。450K采用了两种探针对甲基化进行测定，Infinium I采用了两种bead（甲基化M和非甲基化U，如图显示），而II只有一种bead（即甲基化和非甲基化在一起），这也导致了它们在后续荧光探测的不同，450K采用了两种荧光探测信号（红光和绿光）。

二、分析需要考虑的问题
1、背景校正
2、红光和绿光的校正
3、控制芯片的使用（illumina450K本身有一些控制芯片，可以用来做质控，如亚硫酸盐处理效率）
4、探针类型（I型和II型）的校正（不同探针类型产生的数据不同）
最终我们选择BMIQ的方法（基于ebayes的原理将II型探针的甲基化水平拉伸到I型水平）来做矫正。
5、位置的校正（芯片上的不同位置产生的数据可能会有偏差）
6、批次的校正（不同的批次做的数据会有偏差）
7、探针序列本身是否可靠（有些探针本身位于repeat区或者包含snp等就会影响杂交及最后的结果，应该去除，附上一篇参考文献，里边有list可以用来去除不好的探针）

http://www.biotrainee.com/thread-237-1-1.html
http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/430

平均β=信号B /(信号A +信号B + 100)
通过计算甲基化（信号A）和未甲基化（信号B）等位基因之间的强度比来确定DNA甲基化水平（β值）。
具体地，β值是由甲基化（M对应于信号A）和未甲基化（U对应于信号B）等位基因的强度计算的，荧光信号的比率β= Max（M，0）/ [Max（ M，0）+ Max（U，0）+ 100]。
因此，β值的范围从0（完全未甲基化）到1（完全甲基化）

具体的β值的意义是：

1. 任何等于或大于0.6的β值都被认为是完全甲基化的；
   任何等于或小于0.2的β值被认为是完全未甲基化的；
   β值在0.2和0.6之间被认为是部分甲基化的。

References:

1. Iorio F, Knijnenburg TA, Vis DJ, Bignell GR et al. A Landscape of Pharmacogenomic Interactions in Cancer. Cell 2016 Jul 28;166(3):740-754. PMID: 27397505