一种基于PET和ICT的双功能荧光探针，用于同时识别活细胞中的Cys和H2S

文章解读

       文章设计了一种易于合成的双功能荧光探针NJB，通过明显的颜色和荧光变化用于对Cys和H2S的双位点响应，。在检测过程中，发生了光诱导电子转移 (photoinduced electron transfer, PET)和分子内电荷转移 (ICT)过程，NJB的颜色和荧光也发生了显著变化。该探针还具有出色的选择性，达到识别Cys和HS−的低检测限（Cys：58.4 nM 和 HS−：81.1 nM）。此外，NJB 已被用于在 MCF-7 细胞中成功测试 Cys 和 HS−。该探针有望成为在活细胞中探究Cys和H2S的生理和病理功能的绝佳工具。

一、引言

       已报道的与半胱氨酸(Cys)和硫化氢(H2S)反应的探针大多只能识别一个分析物，或者在识别半胱氨酸(Cys)和H2S时受到同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的干扰。此外，作为硫醇识别位点之一的硝基苯并恶二唑(NBD)醚不可避免地会遇到Cys、GSH和H2S在同一通道上在细胞水平上无法区分的情况（如下图a所示）。在这项工作中，通过引入NBD醚和NBD胺，构建了一种双功能荧光探针NJB，用于通过PET和ICT过程对半胱氨酸和H2S进行双部位反应（如下图b所示）。NJB对半胱氨酸和HS-有很好的选择性，检出限分别为58.4nM和81.1nM。有趣的是，NJB已经成功地应用于检测MCF-7细胞中的Cysa和HS-。因此，作为研究Cys和H2S在活细胞中生理和病理功能的有力工具的探针是很有前途的。

二、实验部分

1. 探针NJB的合成

       按下图得到化合物3。将化合物3（46.2 mg，0.1 mmol）和N-乙基二异丙胺（1 mL）溶于CH2Cl2 （10 mL），然后缓慢滴入4-氯-7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑（59.4 mg，0.3 mmol）。将混合物搅拌2小时，并用去离子水（10 mL × 3）洗涤。除去分离的有机层，得到粗品。粗品用CH2Cl2和 CH3OH以（100/1，V/V）为洗脱液进行柱层析纯化，最后得到的棕红色固体为探针NJB（60.0 mg，65.0%）

          硝基苯并恶二唑(NBD)醚( )与化合物3发生取代反应以及环化反应最终生成目标产物NJB（）。

2. 检测限计算

      研究荧光强度与Cys/H2S浓度的线性关系，并根据“检测限=3σ/K（σ为空白测量标准差，K为校准曲线斜率）”的计算公式，得到NJB检测MCF-7细胞中的Cys和HS-的检测限。

3. 细胞毒性测定

       通过细胞计数试剂盒 （CCK-8） 评估 NJB 的生物相容性。将细胞接种到 96 孔板中并培养过夜。然后，将培养基替换为含有不同浓度NJB（0-30μM）的新鲜培养基，再放置24小时。之后，用含有10%CCK-8的培养基替换培养基，再培养1小时。。酶标仪记录细胞在450nm（A）处的吸光度。

       细胞活力 （100%） =A测试组/A对照组× 100 % 。

4. 外源性囊肿、GSH 和 HS 的成像

       已知N-乙基马来酰亚胺 （NEM） 衍生于马来酸，能烷基化游离巯基，是一种不可逆的半胱氨酸蛋白酶 抑制剂，可以可用于修饰蛋白质和多肽中的半胱氨酸残基。

       在37°C的5%CO2中，将MCF-7细胞接种在玻璃培养皿（35mm）。过夜后，MCF-7细胞被随机分成五组。第 1 组：MCF-7 细胞与 NJB 共孵育 0.5 小时;第 2 组：MCF-7 细胞用 NEM （500 μM） 处理 1 小时，然后与 NJB 孵育 0.5 小时;第 3 组：将 MCF-7 细胞与 Cys （100 μM） 孵育 1 小时，然后与 NJB 再培养 0.5 小时;第 4 组：MCF-7 细胞与 GSH （100 μM） 一起孵育 1 小时，然后与 NJB 再孵育 0.5 小时;第 5 组：MCF-7 细胞与 HS−（100μM） 一起孵育1小时，然后用NJB再培养0.5小时。在相同条件下对每组进行共聚焦激光成像（绿色通道：λex= 488 nm，λem= 533–573 nm;红色通道：λex= 552 nm 和 λem= 580–620 nm）。伪彩色图像由Image Proplus 6.0软件获取。

三、结果与讨论

1、NJB响应Cys和HS-的荧光特性及检出限

         首先，通过体外检测Cys和HS-的光谱行为来研究NJB。由于PET的发生和ICT的抑制作用，游离探针的荧光可以忽略不计。当引入Cys（标记为NJB/Cys）时，由于PET的出现，604 nm附近的荧光信号没有明显变化。然而，在553 nm附近发现了强烈的绿色荧光，溶液从黄褐色变为红色（a）。添加 HS- 后（标记为 NJB/HS），604 nm 处的红色荧光增加，颜色从黄褐色变为红色（c）。553 nm 和 604 nm 处的荧光强度取决于 Cys 和 HS−浓度（b、d中不同颜色曲线代表不同浓度的Cys 和 HS−）。

         重要的是，Cys（0.3-2.7equiv.）和HS-的检测限（0.3-2.3equiv.）分别计算为58.4 nM和81.1 nM。此外，NJB与GSH（0–6.5equiv.）检测限为0.15μM。上述结果均表明，NJB在识别Cys和HS-方面的检出限较低。

c

2、NJB在识别Cys和HS−方面的选择性

      检查各种粒子对 NJB 响应 Cys 和 HS− 的选择性和干扰性，包括Na+, K+, F−, Cl−, Br−, I−, CO32−, HCO3−, Ac−, SO42−, PO43−, NO3−, •OH, O2•−, NO•, ClO−, H2O2, Hcy, GSH, 和 HSO3−离子的影响。

       在NJB中分别引入 Cys 和 HS −上，发现553 nm和604 nm处的荧光发射峰发生了显著变化（图1）。相反，加入上述分析物后，NJB在553 nm和604 nm附近的荧光变化可以忽略不计（图2）。当GSH加入时，它对探针对Cys和HS−的识别产生了一定的影响（图1）。然而，由于PET，NJB的荧光强度（604nm）并未完全释放。553 nm处荧光信号的变化可以忽略不计，因此GSH的干扰仅限于探针对Cys和HS−的识别。正如预期的那样，NJB在识别Cys和HS−方面具有出色的选择性。

图1

图2

3、NJB响应Cys 和 HS−的荧光信号与时间的关系

       此外，NJB的荧光在识别系统中没有随时间的变化而发生明显变化，表明探针可以稳定地存在于系统中。加入Cys后，在478 nm的激发下，553 nm附近NJB的荧光信号随着时间的延长而一寸一寸地增加，并在0.5 h内达到响应平台（a）。加入H2S之后同样在604 nm处NJB的荧光信号随时间逐渐增加，并在2.5 h内到达响应平台（b）。NJB与先前报道的基于NBD胺的HS−荧光探针的比较，可以发现NJB对HS-的检测限较低。

4、NJB响应Cys 和 HS−的荧光信号与pH的关系

       探讨 NJB 是否可以检查 HS− 和Cys在正常生理条件下，进行了pH值对荧光行为的影响实验。游离NJB在553 nm处的信号强度在很宽的pH值范围内保持稳定（2.0-11.0）。随着Cys和HS−的推出，553 nm和604 nm处的最大荧光发射峰分别在4.0-10.0的pH值下表现出最佳响应效果。这些现象表明，NJB在生理pH值的检测中可以发挥正常作用。

5、NJB的细胞毒性

       NJB的细胞毒性直接影响其在细胞中的应用。因此，我们随后采用CCK-8细胞研究了NJB的细胞毒性。即使 NJB 浓度高达 30 μM，细胞也显示出高活力，这清楚地表明 NJB 在细胞成像中表现出明显的生物相容性。考虑到NJB的光谱数据和细胞毒性实验，我们选择10 μM作为NJB的浓度，用于后续的生物应用。

6、NJB原位成像实验

       识别 Cys 和 HS−，随后，进行了NJB随时间推移的原位成像实验。NJB和MCF-7细胞共孵育后，孵育后10 min至1 h，绿色和红色通道的荧光强度没有明显变化，表明探针相对稳定。如图e−h所示，采用N-乙基马来酰亚胺（NEM，一种RSS清除剂）对MCF-7细胞进行预处理，然后用NJB处理MCF-7细胞，绿色和红色通道显示可忽略的荧光信号。此外，绿色和红色通道图像的伪彩色显示，图b、c分别比图f、g显示出更明显的颜色变化。这些行为表明 NJB 能够检查内源性 Cys 和 HS−。加入Cys后，绿色通道的荧光信号显著增强（图j），红色通道的荧光信号也增加（图k）。引入GSH后，绿色通道的荧光信号没有明显变化（图n），而红色通道增加（图o）。当 HS−引入后，绿f色通道的荧光信号没有明显变化（图r），而红色通道则表现出显著的增强（图s）。有趣的是，图s中红色通道的荧光强度强于图k、o中的荧光强度。

       这些现象清楚地表明，NJB有能力在绿色通道中测试Cys，并选择性地区分红色通道中的HS−。检测Cys和HS−的理想双功能荧光探针具有两个优点：（1）能够选择性地响应H2S和Cys，并产生两种不同的荧光信号;（2）具有减少GSH对生物系统干扰的能力。

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不足之处

1）由下图可知在NJB中加入GSH在604 nm附近的荧光无法忽略，说明这种双功能NJB探针识别Cys和HS−时无法完全排除GSH的干扰。

2）这种双功能NJB探针识别Cys和HS−是竞争反应，所以用量是传统单一功能探针的两倍，并且原料对硝基苯并恶二唑(NBD)醚的用量增加，虽然检测限较低，但成本也增加了