文章解读
文章设计了一种易于合成的双功能荧光探针NJB,通过明显的颜色和荧光变化用于对Cys和H2S的双位点响应,。在检测过程中,发生了光诱导电子转移 (photoinduced electron transfer, PET)和分子内电荷转移 (ICT)过程,NJB的颜色和荧光也发生了显著变化。该探针还具有出色的选择性,达到识别Cys和HS−的低检测限(Cys:58.4 nM 和 HS−:81.1 nM)。此外,NJB 已被用于在 MCF-7 细胞中成功测试 Cys 和 HS−。该探针有望成为在活细胞中探究Cys和H2S的生理和病理功能的绝佳工具。
一、引言
已报道的与半胱氨酸(Cys)和硫化氢(H2S)反应的探针大多只能识别一个分析物,或者在识别半胱氨酸(Cys)和H2S时受到同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的干扰。此外,作为硫醇识别位点之一的硝基苯并恶二唑(NBD)醚不可避免地会遇到Cys、GSH和H2S在同一通道上在细胞水平上无法区分的情况(如下图a所示)。在这项工作中,通过引入NBD醚和NBD胺,构建了一种双功能荧光探针NJB,用于通过PET和ICT过程对半胱氨酸和H2S进行双部位反应(如下图b所示)。NJB对半胱氨酸和HS-有很好的选择性,检出限分别为58.4nM和81.1nM。有趣的是,NJB已经成功地应用于检测MCF-7细胞中的Cysa和HS-。因此,作为研究Cys和H2S在活细胞中生理和病理功能的有力工具的探针是很有前途的。
二、实验部分
1. 探针NJB的合成
按下图得到化合物3。将化合物3(46.2 mg,0.1 mmol)和N-乙基二异丙胺(1 mL)溶于CH2Cl2 (10 mL),然后缓慢滴入4-氯-7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑(59.4 mg,0.3 mmol)。将混合物搅拌2小时,并用去离子水(10 mL × 3)洗涤。除去分离的有机层,得到粗品。粗品用CH2Cl2和 CH3OH以(100/1,V/V)为洗脱液进行柱层析纯化,最后得到的棕红色固体为探针NJB(60.0 mg,65.0%)
硝基苯并恶二唑(NBD)醚( )与化合物3发生取代反应以及环化反应最终生成目标产物NJB(
)。
2. 检测限计算
研究荧光强度与Cys/H2S浓度的线性关系,并根据“检测限=3σ/K(σ为空白测量标准差,K为校准曲线斜率)”的计算公式,得到NJB检测MCF-7细胞中的Cys和HS-的检测限。
3. 细胞毒性测定
通过细胞计数试剂盒 (CCK-8) 评估 NJB 的生物相容性。将细胞接种到 96 孔板中并培养过夜。然后,将培养基替换为含有不同浓度NJB(0-30μM)的新鲜培养基,再放置24小时。之后,用含有10%CCK-8的培养基替换培养基,再培养1小时。。酶标仪记录细胞在450nm(A)处的吸光度。
细胞活力 (100%) =A测试组/A对照组× 100 % 。
4. 外源性囊肿、GSH 和 HS 的成像
已知N-乙基马来酰亚胺 (NEM) 衍生于马来酸,能烷基化游离巯基,是一种不可逆的半胱氨酸蛋白酶 抑制剂,可以可用于修饰蛋白质和多肽中的半胱氨酸残基。
在37°C的5%CO2中,将MCF-7细胞接种在玻璃培养皿(35mm)。过夜后,MCF-7细胞被随机分成五组。第 1 组:MCF-7 细胞与 NJB 共孵育 0.5 小时;第 2 组:MCF-7 细胞用 NEM (500 μM) 处理 1 小时,然后与 NJB 孵育 0.5 小时;第 3 组:将 MCF-7 细胞与 Cys (100 μM) 孵育 1 小时,然后与 NJB 再培养 0.5 小时;第 4 组:MCF-7 细胞与 GSH (100 μM) 一起孵育 1 小时,然后与 NJB 再孵育 0.5 小时;第 5 组:MCF-7 细胞与 HS−(100μM) 一起孵育1小时,然后用NJB再培养0.5小时。在相同条件下对每组进行共聚焦激光成像(绿色通道:λex= 488 nm,λem= 533–573 nm;红色通道:λex= 552 nm 和 λem= 580–620 nm)。伪彩色图像由Image Proplus 6.0软件获取。
三、结果与讨论
1、NJB响应Cys和HS-的荧光特性及检出限
首先,通过体外检测Cys和HS-的光谱行为来研究NJB。由于PET的发生和ICT的抑制作用,游离探针的荧光可以忽略不计。当引入Cys(标记为NJB/Cys)时,由于PET的出现,604 nm附近的荧光信号没有明显变化。然而,在553 nm附近发现了强烈的绿色荧光,溶液从黄褐色变为红色(a)。添加 HS- 后(标记为 NJB/HS),604 nm 处的红色荧光增加,颜色从黄褐色变为红色(c)。553 nm 和 604 nm 处的荧光强度取决于 Cys 和 HS−浓度(b、d中不同颜色曲线代表不同浓度的Cys 和 HS−)。
重要的是,Cys(0.3-2.7equiv.)和HS-的检测限(0.3-2.3equiv.)分别计算为58.4 nM和81.1 nM。此外,NJB与GSH(0–6.5equiv.)检测限为0.15μM。上述结果均表明,NJB在识别Cys和HS-方面的检出限较低。
c
2、NJB在识别Cys和HS−方面的选择性
检查各种粒子对 NJB 响应 Cys 和 HS− 的选择性和干扰性,包括Na+, K+, F−, Cl−, Br−, I−, CO32−, HCO3−, Ac−, SO42−, PO43−, NO3−, •OH, O2•−, NO•, ClO−, H2O2, Hcy, GSH, 和 HSO3−离子的影响。
在NJB中分别引入 Cys 和 HS −上,发现553 nm和604 nm处的荧光发射峰发生了显著变化(图1)。相反,加入上述分析物后,NJB在553 nm和604 nm附近的荧光变化可以忽略不计(图2)。当GSH加入时,它对探针对Cys和HS−的识别产生了一定的影响(图1)。然而,由于PET,NJB的荧光强度(604nm)并未完全释放。553 nm处荧光信号的变化可以忽略不计,因此GSH的干扰仅限于探针对Cys和HS−的识别。正如预期的那样,NJB在识别Cys和HS−方面具有出色的选择性。
图1
图2
3、NJB响应Cys 和 HS−的荧光信号与时间的关系
此外,NJB的荧光在识别系统中没有随时间的变化而发生明显变化,表明探针可以稳定地存在于系统中。加入Cys后,在478 nm的激发下,553 nm附近NJB的荧光信号随着时间的延长而一寸一寸地增加,并在0.5 h内达到响应平台(a)。加入H2S之后同样在604 nm处NJB的荧光信号随时间逐渐增加,并在2.5 h内到达响应平台(b)。NJB与先前报道的基于NBD胺的HS−荧光探针的比较,可以发现NJB对HS-的检测限较低。
4、NJB响应Cys 和 HS−的荧光信号与pH的关系
探讨 NJB 是否可以检查 HS− 和Cys在正常生理条件下,进行了pH值对荧光行为的影响实验。游离NJB在553 nm处的信号强度在很宽的pH值范围内保持稳定(2.0-11.0)。随着Cys和HS−的推出,553 nm和604 nm处的最大荧光发射峰分别在4.0-10.0的pH值下表现出最佳响应效果。这些现象表明,NJB在生理pH值的检测中可以发挥正常作用。
5、NJB的细胞毒性
NJB的细胞毒性直接影响其在细胞中的应用。因此,我们随后采用CCK-8细胞研究了NJB的细胞毒性。即使 NJB 浓度高达 30 μM,细胞也显示出高活力,这清楚地表明 NJB 在细胞成像中表现出明显的生物相容性。考虑到NJB的光谱数据和细胞毒性实验,我们选择10 μM作为NJB的浓度,用于后续的生物应用。
6、NJB原位成像实验
识别 Cys 和 HS−,随后,进行了NJB随时间推移的原位成像实验。NJB和MCF-7细胞共孵育后,孵育后10 min至1 h,绿色和红色通道的荧光强度没有明显变化,表明探针相对稳定。如图e−h所示,采用N-乙基马来酰亚胺(NEM,一种RSS清除剂)对MCF-7细胞进行预处理,然后用NJB处理MCF-7细胞,绿色和红色通道显示可忽略的荧光信号。此外,绿色和红色通道图像的伪彩色显示,图b、c分别比图f、g显示出更明显的颜色变化。这些行为表明 NJB 能够检查内源性 Cys 和 HS−。加入Cys后,绿色通道的荧光信号显著增强(图j),红色通道的荧光信号也增加(图k)。引入GSH后,绿色通道的荧光信号没有明显变化(图n),而红色通道增加(图o)。当 HS−引入后,绿f色通道的荧光信号没有明显变化(图r),而红色通道则表现出显著的增强(图s)。有趣的是,图s中红色通道的荧光强度强于图k、o中的荧光强度。
这些现象清楚地表明,NJB有能力在绿色通道中测试Cys,并选择性地区分红色通道中的HS−。检测Cys和HS−的理想双功能荧光探针具有两个优点:(1)能够选择性地响应H2S和Cys,并产生两种不同的荧光信号;(2)具有减少GSH对生物系统干扰的能力。
不足之处
1)由下图可知在NJB中加入GSH在604 nm附近的荧光无法忽略,说明这种双功能NJB探针识别Cys和HS−时无法完全排除GSH的干扰。
2)这种双功能NJB探针识别Cys和HS−是竞争反应,所以用量是传统单一功能探针的两倍,并且原料对硝基苯并恶二唑(NBD)醚的用量增加,虽然检测限较低,但成本也增加了