空间多组学分析显示胶质母细胞瘤具有多层结构

作者，Evil Genius

单细胞分析流程

今日的参考文章在Integrative spatial analysis reveals a multi-layered organization of glioblastoma, 2024年4月22号发表于cell。

胶质瘤包含不同状态的恶性细胞。

结合空间转录组学、空间蛋白质组学和计算方法来定义胶质瘤细胞状态并揭示它们的组织。

大脑肿瘤的微观结构是无限变化的，然而在它们千变万化的外观中，某些相似性结构可以被追踪到。胶质瘤通常是高度异质性和浸润性的，但特定的空间模式广泛地被注意到。

胶质母细胞瘤(GBMs)的复发性空间结构:胶质瘤细胞依赖或模仿大脑原有的正常结构，具有侵袭性的有组织的继发结构;癌细胞的无定形排列;癌细胞形成的模式不依赖于先前存在的正常结构的适当结构;坏死区域周围有间充质组织反应。因此，坏死灶(和缺氧)以及正常大脑神经元结构周围的区域与局部组织有关，而在这些区域之外，胶质瘤组织以缺乏组织学组织为主。

scRNA、CODEX、Visium。

局部肿瘤微环境(TME)是癌细胞状态的主要决定因素。

1、神经胶质瘤的空间转录组学

使用两种初始方法对spot进行分类和标注。首先，通过平均每个染色体区域的基因表达来进行拷贝数畸变(CNA)推断，将spot分类为恶性，非恶性或混合spot。其次，采用Leiden聚类方法对每个样本进行聚类，并在多个切片的情况下对每个肿瘤进行聚类，并通过基因集富集分析对聚类进行注释。当单样本Leiden聚类将样本中相似成分的spot组合在一起时，下一步的目标是更好地捕捉细胞状态的连续性质。为此，对每个样本进行了非负矩阵分解(NMF)，并推导出稳定表达program。

Experimental design and spot classification per sample

Segmentation, CNA inference, and per-sample clustering

2、胶质瘤的复发表达异质性

比较了通过Leiden聚类和NMF在单个GBM样本中鉴定的492个基因表达跑program。

spot的表达谱反映了不同细胞状态的组合

Deriving and annotating spatial metaprograms

Validation and further analysis of spatial metaprograms

Mapping spatial metaprograms to cell states

3、空间蛋白质组学作为胶质瘤图谱的补充

虽然Visium覆盖整个组织，但它的空间分辨率较低，不适合捕获罕见或空间分散的细胞类型和细胞状态。因此，使用CODEX作为补充方法，在真正的单细胞蛋白水平上验证分析结果。40个标记抗体panel是基于单细胞GBM MPs和标准标记设计的，几乎涵盖了所有相关的细胞类型和细胞状态。

对单细胞的蛋白表达谱进行聚类,为了能够直接比较CODEX和Visium数据，使用STalign对两个数据集进行空间对齐。在Visium数据中，一些细胞类型和状态无法通过无监督分析检测到，因为它们倾向于代表它们所在spot的一小部分。例如T细胞和B细胞很少占主导地位，它们的低mRNA含量进一步限制了它们的信号，因此无法通过无监督分析识别T细胞或B细胞MPs（对于Visium）。

CODEX数据能够评估每个state的细胞密度。非恶性脑细胞类型的密度(平均5个细胞/spot)低于恶性细胞、免疫细胞和内皮细胞(平均9个细胞/spot)。在恶性状态中，染色质- REG和MES样密度最大，NPC样、OPC样和AC样密度最小。

Spatial profiling of gliomas by CODEX

GBM profiling by CODEX

4、GBM肿瘤包含共同发生的结构化和非组织化区域

每个样本中相邻spot和分散spot的细胞状态丰富程度，即“空间相关性”。空间相关性因样本而异，例如在一些样本(“结构化”)中，大多数状态往往具有高相关性，而在其他样本(“无组织”)中，大多数状态往往具有低相关性。

根据其局部环境的一致性将每个点分类为属于结构化，无组织或中间区域。结合(CNA分数)进一步细分结构化和无组织区域，对空间结构进行定义。

Spatial distribution of cell states and organization zones

Association between spatial coherence and MES-Hyp

Spatial coherence and organizational zones

5、癌细胞状态的空间组织与MES-Hyp（缺氧类的间质细胞）丰度有关

MES-Hyp在Struct-Malig（恶性）区富集。即使从空间相关性计算中去除MES-Hyp spot，富含MES-Hyp的样品仍具有较高的空间相关性。因此，与缺氧相关的组织增加超出了缺氧癌细胞状态本身，靠近MES-Hyp spot的所有恶性细胞状态都比缺乏MES-Hyp spot的相同细胞状态更有组织。因此，缺氧周围的结构区明显比与缺氧相关的两种组织学注释——pseudopalisading and necrosis (PAN) and MVP更为多样。虽然神经元spot在空间上也是高度连贯的，但在含有神经元的区域中没有观察到这种扩展结构对相邻细胞状态的影响。因此，缺氧可能提供了一种外在的力量，在大的组织区域上赋予了表达状态的结构连续体，从而形成了一个已知的局部结构，通过组织学可以看到，而一个以前未被发现的远程结构可以通过细胞状态的分子谱检测到。在GBM和IDH突变的胶质瘤中，非缺氧区在很大程度上是disorganized(Disorg-Malig)，这与组织学上看到的胶质瘤的整体disorganization一致。

如果缺氧是空间组织的驱动因素，那么将无序的GBM类器官置于缺氧条件下可能会诱导癌细胞状态的组织，实验表明完全的状态转变可能需要长期暴露于缺氧和/或坏死、免疫细胞和血管。此外，类器官模型研究包含核心恶性GBM细胞状态，但它并没有稳定地再现人类肿瘤样本的空间组织，即使在含有MES-Hyp的对照类器官中也是如此。

6、Pairwise state-state spatial associations recur across samples and scales

为了量化细胞状态之间的空间关系，设计了三个互补的度量，突出了不同分辨率水平下的状态耦合。首先，两种状态的区域组成，定义为它们在预定义半径(用r表示)的六边形窗口上的丰度之间的相关性。其次，两种细胞状态之间的邻接性，定义为一种状态在另一种状态的直接邻近spot上的富集。第三，同一region内两个state的共定位。分析观察到在大范围的区域中状态关系的总体一致性，同时在考虑所有measures时也确定了特定的scale-dependent shifts(distance-dependent coupling)(结构化region的measures之间的一致性为67%，无组织region的measures之间的一致性为57%)。

从区域组成上看，结构化和无序区域具有相似数量的显著空间关联，且这些关联在很大程度上是一致的，而共定位和邻接度量主要识别结构化区域特有的相互作用。因此，即使在没有由邻近细胞或spot定义的直接空间格局的情况下，区域组成也趋于保持。接下来就是要分析细胞间的共定位。

Spatial associations between states across scales

Spatial relationship analysis

7、结构化区域GBM空间组织的分层模型

为了检验上述细胞间相互作用是否可以组合形成一个高阶组织，分析生成了一个网络图，其中node代表状态，edge代表共识相互作用。该图显示了一个五层组织，其中dege只存在于同一层内或相邻层之间。这种组织似乎以缺氧梯度为主，第一层由MES-Hyp (L1:核心缺氧/坏死)组成，其次是第二层由MES-Ast、MES-like和inflammaty - mac (L2:缺氧相关)组成。第三层包括可能有助于解决缺氧的免疫和血管生成相关的细胞类型和状态，包括Vasc、Mac和增殖- metab (L3:血管生成反应/免疫中枢)。L3后，缺氧可能被解决，使得神经发育恶性状态的存在可能更加依赖氧气- AC-like，OPC-like和NPC-like(L4:恶性神经发育状态)。最后，非恶性脑细胞类型(反应性AST、寡糖和神经元)反映了向浸润脑实质(L5:脑实质)的转变。将spot映射到五层保留了结构化和无组织区域之间的区别。CODEX数据在L3(血管生成反应/免疫中枢)中添加B细胞和T细胞后生成了类似的结构。

为了更好地理解我们的层模型，将样本分配到五个结构，并与神经病理学家的组织病理学注释和来自组织病理学特征的IVY Gap转录特征进行了比较。研究发现模型与经典注释高度一致，L1类似于PAN, L3类似于MVP, L4类似于细胞肿瘤，L5类似于前沿。值得注意的是，缺氧邻近层(L2)和局部缺氧的小区域不能通过经典的组织病理学或IVY Gap转录程序来区分。同样，将来自五层的转录特征与对应于显微解剖组织病理学特征的转录特征进行比较，除了L2不能直接映射到组织病理学特征外，总体上是一致的。因此，通过对基因表达的无监督分析，在很大程度上趋同于胶质瘤的主要组织学特征，但准确性提高了，并增加了一个新的低氧邻近状态层(L2)。此外，可以在细胞状态的详细分辨率上重新定义经典的组织病理学特征。

A layered model of GBM spatial organization

GBM state layers

结合Visium与CODEX和计算方法来定义胶质瘤的组织。

具有有限空间聚类的细胞状态信号被Visium稀释，可能无法通过无监督分析检测到，如细胞周期和低丰度细胞类型(如T细胞)的情况。

研究发现了三种空间组织模式。首先，细胞倾向于被处于相同状态的其他细胞所包围(特定状态的cluster)，形成了高度富集的个体状态的局部环境。这种模式可以从每个spot内相似细胞的聚类以及分配给同一MP的spot的聚类来证明。这种聚类表明空间位置在调节细胞状态中起着核心作用。

最后更新一个小内容，就是关于单细胞空间突变信息分析导论提到的突变信息，那么如何知道单细胞空间检测到的时候是热点突变位点，大家可以参考cancer hotspots,网址在http://www.cancerhotspots.org/#/home。

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