NBT：王运浩、区健辉等综述纳米孔测序技术

2021年11月8日，美国俄亥俄州立大学（Ohio State University）区健辉（Kin Fai Au）研究组在Nature Biotechnology在线发表综述论文Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications，该文章系统全面地回顾总结了纳米孔测序技术的发展历史、技术原理、数据特征、生物信息学分析方法以及广泛的应用， 同时也指出了目前存在的问题。

自从牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）于2014年推出第一款商业化的纳米孔测序仪MinION以来，近几年纳米孔测序技术以及相关的应用都取得了实质的进步。ONT纳米孔测序技术的原理主要依赖于具有生物传感性、内部直径为纳米尺度的蛋白质（nanopore）。在电解质溶液中，通过施加电压，将带有负电荷的单链DNA或RNA分子驱动穿过纳米孔。同时，利用分子马达蛋白（motor protein）控制DNA或RNA分子的穿孔速度。DNA和RNA碱基序列穿过纳米孔传感区域时所引起的电流变化被实时记录，并通过生物信息学算法将这些变化的电信号解码为核苷酸碱基。

米孔测序的概念最早可追溯至20世纪80年代【1】。目前的纳米孔测序技术主要包括两个核心组分：纳米孔蛋白和分子马达蛋白。第一个被用于纳米孔测序的纳米孔蛋白为alpha-hemolysin, 其内部直径为1.4至2.4纳米；随后，另外一个具有相似内部直径（1.2纳米）的蛋白MspA也被证实可以用于纳米孔测序。分子马达蛋白（比如phi29 DNA聚合酶）的应用使得DNA或RNA分子穿过纳米孔蛋白的速度得到了稳定的控制，进而极大地改善了测序的准确性；同时，分子马达蛋白可以将双链DNA或者RNA-DNA杂合体解链为单链分子。

图1. 纳米孔测序原理图

图2. 纳米孔测序发展

截至目前，ONT公司相继更新了8个版本的测序系统（从最初的R6到最新的R10.3版本），并推出了适合不同测序通量需求的测序仪 （比如，中等通量的GridION、高通量的PromethION）。ONT测序的准确性从最早的64%增加至如今的95%；目前的测序长度（N50）可以达到50 kb，报道的最长测序长度为2.273 Mb【2】；测序通量也得到了较大的改善，目前，单个PromethION 芯片（flow cell）可以产出大约150 Gb DNA测序数据。特别值得注意的是，ONT可以对RNA分子直接进行测序，因此保留了RNA上的表观修饰信息（比如, m6A）。

图3. 纳米孔测序建库流程

图4. 数据分析流程

进一步，该文章概述了基于ONT测序数据的生物信息学分析模块：碱基识别（base calling）、DNA（比如，5mC）和RNA（比如，m6A）表观修饰的直接鉴定、测序读长（read）的错误矫正、序列比对（alignment）、基因组组装、结构变异检测、基因组重复序列分析以及转录组分析。基于对近些年已发表文章的系统统计，作者详述了ONT测序在11个主要方面的应用：完善已有的参考基因组序列，构建新的参考基因组，鉴定相对较大的基因组结构变异，构建全长转录组并分析复杂的转录事件，研究基因组表观遗传标记，检测RNA表观修饰，以及在癌症、感染疾病、遗传疾病、病源监测和其他方面的定点（on-site）应用。最后，作者指出了未来ONT测序需要改进的层面：更高的测序准确性（>99%）、更长的测序长度 (Megabase)、降低测序所需的DNA和RNA样品量。

该文章为了解纳米孔测序技术的原理、特点、分析和应用提供了详实的信息。区健辉课题组的王运浩博士、赵月博士以及研究生Audrey Bollas为共同第一作者。

区健辉课题组(http://augroup.org)长期致力于第三代测序技术（PacBio和ONT）领域的研究，主要涉及第三代测序技术在转录组、表观基因组和表观转录组方面的方法学开发以及生物学应用。目前，该课题组正在招聘博士后，欢迎联系。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01108-x

引文 ：Yunhao Wang, Yue Zhao, Audrey Bollas, Yuru Wang, Kin Fai Au. Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications. Nature Biotechnology 2021,39:1348, https://doi.org/10.1038/s41587-021-01108-x

猜你喜欢

10000+：菌群分析 宝宝与猫狗 梅毒狂想曲 提DNA发Nature Cell专刊 肠道指挥大脑

系列教程：微生物组入门 Biostar 微生物组  宏基因组

专业技能：学术图表 高分文章 生信宝典 不可或缺的人

一文读懂：宏基因组 寄生虫益处 进化树

必备技能：提问 搜索  Endnote

文献阅读 热心肠 SemanticScholar Geenmedical

扩增子分析：图表解读 分析流程 统计绘图

16S功能预测   PICRUSt  FAPROTAX  Bugbase Tax4Fun

在线工具：16S预测培养基 生信绘图

科研经验：云笔记  云协作 公众号

编程模板: Shell  R Perl

生物科普:  肠道细菌 人体上的生命 生命大跃进  细胞暗战 人体奥秘  

写在后面

为鼓励读者交流、快速解决科研困难，我们建立了“宏基因组”专业讨论群，目前己有国内外5000+ 一线科研人员加入。参与讨论，获得专业解答，欢迎分享此文至朋友圈，并扫码加主编好友带你入群，务必备注“姓名-单位-研究方向-职称/年级”。PI请明示身份，另有海内外微生物相关PI群供大佬合作交流。技术问题寻求帮助，首先阅读《如何优雅的提问》学习解决问题思路，仍未解决群内讨论，问题不私聊，帮助同行。

学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

点击阅读原文，跳转最新文章目录阅读