第五课 RNAseq样品提取与处理
- RNA-Seq实验流程
- 总RNA提取
- 样品检测(主要检测样品是否合格,是否发生降解等)
- 样品要求
- 合格的样品(只有1-2个峰,且长度在1000-4000)
- 不合格的样品
- 样品检测等级,A最好,D最差
- 低质量样品影响
- 总RNA提取,(由于总RNA中包含各种类型的RNA,而常用的是对mRNA进行处理,因此需要在总RNA中提取这1%-5%的mRNA)
- 而提取mRNA方法有以下两种:
- 第一 通过多个连续的T与polyA尾巴结合,找到mRNA
- 第二 通过去除95%左右的核糖体RNA,剩余5%大约为mRNA
- 原核生物纯化(只能通过去除核糖体的方式)
- 下图是减法杂交与核酸外切酶消化两种方法
- 减法杂交与核酸外切酶消化两种方法效率,结果显示 减法杂交的效果更好
- 两种富集方法比较
- 一般来说真核RNA采用磁珠富集方法
- 原核选择去除核糖体RNA的方法,因为这会留下更多信息.而选择polyA方法容易忽略掉那些没有polyA尾巴的mRNA,这部分又常常被人们所关注.
第六课 RNAseq建库测序
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在测序前需要将mRNA反转录为cDNA,对cDNA测序
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这里存在一个问题,是先反转录后打断还是先打断后反转录,由于短序列反转录更容易,所以一般选择先打断后反转录.下面是两种方法比较
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红色表示先打断后反转录;蓝色表示先反转录后打断.可以看到红色更稳定
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文库大小的选择
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文库构建
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建库测序流程
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注意事项
第7课 链特异性文库
- 链特异性文库,即知道该链是反转录中的哪条链(可以知道reads来自cDNA的第一条链还是第二条链)
- 编码链和模板链
- 与mRNA互补的为编码链;与mRNA对应T U不同的为模板链
有的基因的正义链是正链(forword strand),有的基因的正义链是反链(reverse strand)。所以,DNA双链中的一条链对某些基因来说是正义链,对另一些基因来说则是反义链。(https://blog.csdn.net/sixu_9days/article/details/81222407)
由于DNA对于一部分为正义链,一部分为反义链;有没有一种可能是我拿到一条序列之后,把他的互补链也作为一个样本。
所以,这里有个问题是,我要确定这两条链的关系,转录时候确定是某一条链吗??转录的链有什么规律
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fr-unstranded 非特异性; fr-firststrand和fr-secondstrand为特异性
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链特异性文库优势(没看懂下面几个优势什么)
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链特异发现的可变位点数目较少
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下面图显示,这会造成认为基因表达量偏高
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普通文库构建流程
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特异性文库
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链特异性文库reads方向