单细胞专题（1） | 单细胞转录组研究样本准备指南（上）

前言

      单细胞RNA测序（scRNA-seq）是目前最前沿，能进行大规模实验的转录组研究技术，为理解细胞组成和动态生物学过程提供了很多新的见解。单细胞研究已经为我们理解发育过程，老化和疾病（如癌症）等提供了大量数据。在这里，小编主要就前期的样本准备与保存需注意问题给大家进行讲解，以备大家在不同的研究场景和研究背景下，走好单细胞转录组学研究的第一步。

1.细胞样本

细胞准备量：

细胞总量＞5×10^5 cells

采集及运输：

外周血（PBMC）单核细胞

· 通常采用Ficoll密度梯度离心法分离血液中的PBMC细胞。

· 如不能立即进行单细胞测序实验，在提取到状态良好的PBMC后，可选择冻存后寄送。

培养细胞

·悬浮细胞可直接将细胞悬液轻柔吹打混匀；贴壁细胞一般用0.25%的Trypsin-EDTA酶消化解离；脆弱细胞系使用强度稍弱的胶原酶进行处理，有效保证细胞活率。用含 0.05% BSA的PBS（或常规培养基）或含5%的FBS重悬清洗细胞。

· 2-8℃放置，2h内进行单细胞微反应体系的构建。对于需运输或者保存的细胞，可冻存处理。

细胞冻存：

· 将10^6~10^7个细胞，重悬于1mL细胞冻存液中，转移入外螺旋式冻存管，程序降温至-80℃，转移至液氮中长期保存。冻存细胞干冰运输到公司实验室，在3个月内复苏细胞进行后续实验。

· 冻存细胞的规范性对细胞冻存质量影响较大，需严格遵守梯度冻存程序。

2.组织样本

样本采集

1. 新鲜组织：样本量≥200mg（至少黄豆大小）；

2. 穿刺组织：≥2条（长度1.5cm，直径≥1.5mm）；

保存及运输

      新鲜组织样本要求全部浸没于预冷的美天旎组织保存液（Miltenyi，货号：130-100-008）2ml离心管中，并保持4℃环境。

      用气泡袋包裹放有组织的离心管，并在气泡袋周围放上冰袋，切记不可冰袋直接接触样本，离体 48h 内运输至公司实验室开展单细胞测序实验。

注意事项：

1. 取样一致：实验组与对照组样本的采集状态尽量保持一致

      选取临床组织的获取对象，需综合考虑饮食、烟酒习惯、药物、生物钟时间规律等多种影响因素；选取动物组织的获取对象，需综合考虑实验动物的品系、周龄/月龄、性别、饲养条件、健康状况、实验表型等多种影响因素；建议实验组样本与对照组样本的采集状态尽量保持一致，以尽可能降低其它未知因素对单细胞测序实验结果的影响。 

2. 取样准确：尽量剔除非目标组织，如多余脂肪、包膜；清洗去除血液残留

      血液清洗：使用 1×DPBS 或生理盐水对取样后的组织样本即时反复清洗，尽可能去除血细胞。

      凝固的血液影响解离效果，血液中有有核细胞，裂红液无法去除血液样本中的有核细胞。

3.保持湿润：取样后尽快转入组织保存液中

      样本在空气中长时间暴露，容易出现组织表面细胞的脱水死亡。对于直径偏小的组织，长时间暴露可能直接导致样本无法获取足够的单细胞悬液。例如：穿刺样本、活检钳取样的小直径颗粒组织。

4.避免污损：避免化学试剂污染及热损伤

      如不可避免需使用激光刀、电刀等样本采集工具，应剔除热损伤部分；活检取样每次夹取的样本最好取大块，以减少细胞损伤，对后续实验造成不可逆的影响。

3.液体样本处理

样本类型         取样量                           保存及运输

PBMC              ≥4ml            EDTA抗凝采血管收集，采样后及时颠倒混匀，取样后4℃运输，8h内                                              运送至实验室

淋巴液              ≥4ml           取样后加入5-10%体积比的FBS进行保护，取样后4℃运输，4h运输至                                              实验室

脑脊液              ≥4ml           脑脊液中细胞对环境温度变化较为敏感，处理中不宜温差过大，离体

                                            时间不宜过长，取样后4℃运输，2h运输至实验室

4.类器官样本

类器官简介：

      类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物（通常包含多种细胞类型）。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能，并能够长期稳定传代培养。与动物模型相比，类器官模型的操作更简单，还能用于研究疾病发生和发展等机理。

      类器官通常培养于细胞外基质构成的基质胶中，包含一些层粘连蛋白、胶原蛋白、生长因子等，可以在4°C 溶化为液体，并且可以在37°C重新凝固，为细胞在空间中生长提供重要的微环境与组织支撑。

常温运输：

      类器官，由于类型不一，所以取样和运输环境要求不同。常规的组织、器官或者细胞需要低温运输；但是，如神经类的类器官低温运输，或者离开生长环境之后组织质量会有明显下降；所以类器官建议常温运输，对于夏季较为炎热的地区，运输需要少量冰袋维持环境温度不能过高，冰袋不能直接接触样本，要远距离（20cm左右）隔离；对于冬季温度较低的运输环境，需要保证室温~37℃的运输环境。

5.冰冻抽核样本

      对于冰冻组织样本，直接抽提细胞核进行后续的转录组测序分析。

      单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）区别于常规的单细胞转录组测序，不需要酶解消化，一定程度上打破了新鲜组织样本解离和运输的局限性，能够更真实反应细胞组成情况，在特殊样本处理和珍贵样本转录组信息获得上存在独特优势。

取样及保存：

      抽核组织取样后如果有大量血液需要用DPBS或者生理盐水清洗后，吸水纸尽量去除水分，液氮速冻后-80℃或者液氮存储。-80℃长期存储的样本需要在离心管外，套上1-2层封口袋，尽量减少组织失水的情况发生（此步类似空转组织保存）。存储超过1个月以上的组织抽核前最好做一次RNA提取质检，保证RNA的完整性后再进行下游实验。

干冰运输：

      冻存组织样本用干冰运输至公司实验室。保证干冰充足，确保样本到达时仍处于冻存的环境。可根据运输距离、温度、快递实时情况等，按照每天消耗1.5kg干冰的量适当添加干冰。

6.特殊样本处理

组织特殊

细胞脆弱：建议直接抽核获得单核悬液

      对于细胞脆弱的组织，如肝实质细胞或成熟脂肪细胞，容易破裂，且细胞较大，通过酶解消化，很难拿到目的细胞比例较高的单细胞悬液，建议组织直接抽核获得单核悬液。

高脂肪含量：建议抽核

      对于脂肪含量较高的组织，脂质密度低，所以解离离心过程中处于漂浮或者悬浮状态，不易沉底（未成熟脂肪细胞除外），离心弃上清及收集过筛之后成熟脂肪细胞容易去除，只有部分未成熟脂肪细胞在离心时能沉底富集，被上机捕获，但占比有限。

细胞异型：建议抽核，获取单细胞核悬液

      对于细胞异型的组织，如肌肉、心脏、脑、神经等组织，由于细胞直径过大，不能通过微流控芯片，容易造成芯片管道堵塞，微滴生成失败，建议选用抽核的方式，获取单细胞核测序数据。

易降解：避免过度清洗，且不要长途运输

      对于自身容易降解的样本，如胰腺（自身分泌酶液）、小鼠肠道（肠道含有消化食物酶）等，需注意避免过度清洗，且尽量不要长途运输，尽快消化上机。

高度损伤或病变组织：包含周围组织进行保护

      既要考虑课题需要，又要保证组织良好状态（如：高度损伤或者病变的目标组织，取样往往需要更多组织量，包含周边区域组织进行保护。

7.非模式动物

      除常规物种人、猴，小鼠、大鼠等哺乳动物外，单细胞测序也广泛应用在淡水生物、海洋动物、爬行动物、两栖动物、禽类、昆虫、植物等（如：斑马鱼，水母，蛇，蛙类，鸟禽类，果蝇，寄生虫，水螅，拟南芥，作物，珍惜保护植物）诸多物种中，需要根据物种特性及其生存环境，在取样、保存及运输条件上进行调整。

以下经验可供参考：

送样量：0.5 cm3

保存介质：模拟物种生存环境

      需要模拟物种生存环境或相应细胞系培养环境，制定取样、保存及运输方式。特殊样本由于自身特点，即便用好的保存介质也需要特殊处理，才能高质量保存。如：变态发育动物肺组织、脂肪组织，由于存在肺泡结构或高脂肪含量，在保存液中处于漂浮状态。

送样时间：避免远距离运输

      远距离运输对部分类型，或者特殊处理的组织样本细胞活率影响较大（如：造模的缺氧神经类组织，关注免疫细胞的新鲜血样）。

送样温度：恒温

      由于生存环境差异，对同样温度敏感有差异，所以保存温度的要求不能一概而论，需要针对性进行调整（如：粒细胞不喜欢低温刺激，特别是反复变温）。

细胞分选样本制备将在下期讲解，请持续关注哦！