7+细胞焦亡+ceRNA+实验验证，如何脱离套路求创新？

导语

今天给同学们分享一篇生信文章“Dissection of pyroptosis-related prognostic signature and CASP6-mediated regulation in pancreatic adenocarcinoma: new sights to clinical decision-making”，这篇文章发表在Apoptosis期刊上，影响因子为7.2。

结果解读：

在胰腺导管腺癌中识别PRGs的表达

作者使用TCGA和GTEx数据集在PAAD和正常组织中鉴定了33个PRGs的表达情况，结果显示有31个基因上调，而另外两个基因（GSDME和PJVK）未被检测到（图1A）。根据STRING数据库，PPI网络显示AIM2、PYCARD、CASP1、CASP5、CASP8、GSDMD、NLRC4、NLRP1和NLRP3是关键基因（图1B）。通过相关性分析确定了这些基因之间的相互关系（图1C）。

PRGs的功能富集分析

为了阐明PRGs的作用，使用Metascape进行了GO和KEGG分析。GO分子功能分析显示，33个PRGs主要与半胱氨酸型内切肽酶活性、特定蛋白结构域结合、磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸结合、细胞因子受体结合以及caspase活化和招募结构域结合相关。GO生物过程分析表明，33个PRGs主要参与火焰杆菌感染、对细菌的反应、白细胞介素-1β产生的正调控、对脂多糖的反应以及凋亡信号通路。作者还发现，在GO细胞组分分析中，这33个PRGs主要参与炎症小体复合物、细胞体、吞噬小泡和分泌颗粒腔。KEGG通路分析显示，这33个PRGs与NOD样受体信号通路、沙门菌感染、结核病、凋亡以及中性粒细胞外陷阱形成相关。

构建和评估PRGs预测基因特征

使用单变量Cox回归分析评估PAAD患者PRGs的预后。作者确定了10个具有临床预后价值的基因：AIM2，CASP3，CASP4，CASP5，CASP6，CASP8，GSDMC，IL18，NLRP2和PYCARD（图1D）。此外，Kaplan-Meier曲线显示，PAAD患者中AIM2（图2A，P = 0.012），CASP3（图2B，P = 0.009），CASP4（图2C，P = 0.021），CASP5（图2D，P = 0.035），CASP6（图2E，P = 0.032），CASP8（图2F，P = 0.034），GSDMC（图2G，P = 0.024），IL18（图2H，P = 0.032），NLRP2（图2I，P = 0.002）和PYCARD（图2J，P = 0.028）表达低的患者存活时间较长。基于上述预后基因，作者使用LASSO Cox回归建立了一个新的PRG签名（图3A，B）。根据中位风险评分，将PAAD患者分为低风险组和高风险组。作者发现较高的风险评分与死亡风险增加相关（图3C）。接下来，Kaplan-Meier曲线显示，低风险组的PAAD患者预后较高风险组更好（图3D，P < 0.001，HR 2.154，95%CI 1.412-3.285）。此外，作者进一步使用ROC曲线研究了生存概率，结果显示在1年时曲线下面积为0.689（95%CI 0.609–0.770），在3年时为0.794（95%CI 0.707–0.881），在5年时为0.814（95%CI 0.679–0.956）（图3E）。

Nomogram的开发和校准

结合预后相关基因（PRGs）和临床病理特征，作者实施了一个预测性诺模图来预测生存概率。单变量和多变量回归分析显示CASP8、GSDMC、年龄和新肿瘤类型是影响PAAD患者预后的独立因素（图4A、B）。然后，作者基于CASP3、CASP5、CASP8、GSDMC、年龄和肿瘤状态构建了一个临床预测诺模图。诺模图表明1年、3年和5年的生存概率具有强大的预测性能。此外，校准曲线与诺模图显示出良好的一致性（图4C、D）。

TMB、免疫检查点和免疫浸润的分析

证据表明，TMB是癌症的预测性生物标志物。如图5A所示，作者发现这些预后10个基因与各种免疫抑制剂和激活剂呈正相关，除了CASP6。作者还调查了这些预后基因与PAAD中TMB之间的相关性，以评估PRGs在免疫治疗中是否起到重要作用。结果显示，TMB与CASP3呈正相关（图5C，P = 0.024），与CASP5呈正相关（图5E，P = 0.012），与CASP6呈正相关（图5F，P = 0.000135），与CASP8呈正相关（图5G，P = 0.035），与IL18呈正相关（图5I，P = 0.014），与PYCARD呈正相关（图5K，P = 0.001），但与其他AIM2无显著关系（图5B，P = 0.377），与CASP4无显著关系（图5D，P = 0.139），与GSDMC无显著关系（图5H，P = 0.868），与NLRP2无显著关系（图5J，P = 0.783）。此外，作者评估了预后PRGs中免疫浸润细胞的价值。作者观察到AIM2表达与B细胞（P = 9.35e−7）、CD8 + T细胞（P = 1.61e−3）、CD4 + T细胞（P = 6.95e−8，cor = 0.4）、巨噬细胞（P = 1.98e−5）、中性粒细胞（P = 1.65e−8）和树突状细胞（P = 2.73e−12）的丰度呈正相关（图S1A）。CASP3（图S1B）、CASP4（图S1C）、CASP5（图 S1D）和CASP8（图S2A）的表达与CD4 + T细胞的免疫浸润相关。此外，CASP6的表达与B细胞（P = 6.94e−3）、CD8 + T细胞（P = 4.91e−4）和树突状细胞（P = 3.35e−2）呈正相关，与CD4 + T细胞（P = 3.97e−2）呈负相关（图S1E）。GSDMC（图S2B）和IL18（图S2C）的表达与CD8 + T细胞、中性粒细胞和树突状细胞呈正相关。PYCARD与CD8 + T细胞（P = 2.14e−3）和巨噬细胞（P = 4.73e−4）呈负相关，与CD4 + T细胞（P = 1.13e−3）呈正相关（图S2E）。然而，NLRP2的表达在免疫浸润细胞之间没有显著差异（图S2D）。这些结果表明PRGs与肿瘤免疫浸润之间存在显著相关性。

CeRNA（长链非编码RNA-微小RNA-信使RNA）调控轴的鉴定

首先，作者阐明了预后相关基因（PRGs）与临床分期之间的关联（图6A）。结果显示，临床分期与CASP4（P = 5.82e−5）、CASP6（P = 0.0351）、CASP8（P = 9.03e−5）、IL18（P = 0.000743）和PYCARD（P = 0.00801）密切相关，但与AIM2（P = 0.309）、CASP3（P = 0.408）、CASP5（P = 0.545）、GSDMC（P = 0.703）和NLRP2（P = 0.703）无关。基于以上五个显著基因，作者使用TarBase V.8数据库预测上游miRNA，获得94个mRNA-miRNA对（附表2）。作者进一步使用starBase数据库评估了这些预测miRNA在胰腺导管腺癌（PAAD）中的表达和预后情况，发现只有hsa-miR-16-5p（CASP6和CASP8的上游miRNA）（图6B，P < 0.001）和hsa-miR-26a-5p（PYCARD的上游miRNA）（图6C，P = 0.025）与PAAD患者的不良生存率相关（图6B，P = 0.041，图6C，P = 0.025）。此外，作者使用miRNet数据库探索了hsa-miR-16-5p和hsa-miR-26a-5p的上游lncRNA，并确定了155个miRNA-lncRNA对（附表3）。最后，作者使用GEPIA和starBase数据库分析了这些lncRNA在PAAD中的表达和预后情况。结果显示，仅PVT1（hsa-miR-16-5p上游长链非编码RNA）的上调（图6D，P < 0.05）在PAAD患者中预后较差（P = 0.041）。因此，lncRNA PVT1/hsa-miR-16-5p/CASP6/CASP8调控轴可能是PAAD进展中的关键ceRNA网络（图6E）。

CASP6的击倒抑制了PANC-1细胞的体外增殖、迁移和侵袭

通过qRT-PCR和Western blotting验证了CASP6在PANC-1细胞中的沉默效果，并选择了具有更好沉默效果的siCASP6-2组进行进一步分析（图7A-C）。在图7D中，CASP6的沉默抑制了PANC-1细胞在CCK-8实验中的活性（P < 0.05）。创伤愈合实验表明，CASP6的沉默明显降低了PANC-1细胞的迁移能力（P < 0.05）（图7E）。此外，Transwell实验显示，与对照组相比，siCASP6-2组的侵袭细胞数量显著减少（P < 0.05）（图7F）。

总结

PRGs与预后、TMB、免疫检查点和免疫浸润有关，CASP6可能是一个潜在的生物标志物，在PAAD的发生和进展中起促进作用。体外实验证实了CASP6在PAAD中的致癌基因作用，CASP6抑制阻止了PANC-1细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，作者首次确定了PAAD进展中的一个关键ceRNA调控轴lncRNA PVT1/hsa-miR-16-5p/CASP6/CASP8。本研究初步揭示了PAAD进展的潜在生物标志物和分子机制，有助于发现治疗靶点。对这篇文章的思路感兴趣的老师，欢迎咨询！