HiFi测序

HiFi测序（High-Fidelity Sequencing）是一种由PacBio公司开发的先进DNA测序技术，基于其单分子实时测序（SMRT, Single Molecule Real-Time Sequencing）平台。HiFi测序结合了长读长和高准确性的优势，已成为基因组学、医学研究、农业育种等领域的重要工具。

以下是HiFi测序的介绍：

---

技术原理

1. 单分子实时测序（SMRT）

   • PacBio测序仪使用SMRT芯片（ZMW芯片）进行测序。每个孔（ZMW，Zero-Mode Waveguide）中包含一个DNA分子和一个聚合酶。

   • 荧光标记的核苷酸会在被聚合酶加入DNA链时发出特定颜色的荧光，摄像头实时记录下每种核苷酸的加入过程。

2. 环状模板（CCS, Circular Consensus Sequencing）

   • HiFi测序利用一种称为“环状一致性序列”（CCS）的技术。目标DNA通过发夹结构连接形成环状，使得同一分子可以被反复测序。

   • 通过对一个DNA分子多次测序，生成高质量的共识序列，从而显著提高了测序准确性。

---

主要特点

1. 长读长（Read Length）

   • HiFi测序平均读长可达到15-25 kb以上，比传统短读长测序技术（如Illumina）更长。

   • 适合解决复杂基因组区域（如重复序列和结构变异）的解析。

2. 高准确性

   • HiFi读长的准确性可达99.9%以上（Q30），接近短读长技术的水平。

   • 这通过重复读取相同的DNA片段并生成共识序列实现。

3. 低错误率

   • HiFi测序的错误主要为随机错误，通过CCS算法可以有效校正，大幅减少系统性错误。

4. 无PCR偏好性

   • HiFi测序通常不需要PCR扩增，避免了PCR引入的偏差和错误，能够更好地反映样本的真实状态。

---

优点

1. 精准检测复杂变异

   • 长读长和高准确性使HiFi测序能够准确解析重复区域、大片段插入/缺失（Indels）和结构变异。

   • 在单倍型分辨和基因组组装中表现优异。

2. 全面表征基因组

   • 能同时捕获点突变、表观遗传修饰（如甲基化）、可变剪切等多层次信息。

3. 适用多样样本

   • 包括人类、植物、动物、微生物等样本，尤其是复杂或高重复性的基因组。

4. 简化的分析流程

   • 高准确率降低了对复杂后续分析的需求。

---

局限性

1. 成本较高

   • 虽然HiFi测序精度高，但测序仪器及运行成本仍较昂贵，不适合预算有限的研究。

2. 通量相对较低

   • 相比于Illumina短读长技术，HiFi测序的通量较低，可能不适合大规模样本的高通量需求。

3. 数据处理需求高

   • 由于生成的数据量大，需要高性能计算资源来处理和分析。

---

应用领域

1. 基因组组装

   • 尤其适用于高重复或多倍体基因组的精准组装，如植物基因组和癌症基因组。

2. 变异检测

   • 包括单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（Indel）、结构变异（SV）。

3. 单倍型分析

   • 凭借长读长能力，HiFi测序可以准确分离单倍型，应用于遗传研究和药物研发。

4. 表观遗传学

   • 能够直接检测DNA甲基化等表观遗传修饰，无需额外试剂处理。

5. 医学研究

   • 包括癌症研究、罕见病研究以及精准医学。

6. 微生物多样性

   • 在微生物组学研究中用于全长16S rRNA基因分析，解析微生物种群结构。

---

发展趋势

随着测序技术的快速发展，HiFi测序正朝着更高通量、更低成本、更简化操作的方向发展。新一代HiFi测序仪（如Revio）将进一步推动这项技术在研究和临床中的广泛应用。

HiFi测序数据分析流程涉及多个步骤，从原始数据的处理到最终的生物学解读。以下是一个分析代码流程示例，基于常用工具和方法：

---

1. 原始数据准备

HiFi测序生成的原始数据通常是 .bam 格式文件（Subreads BAM），包含测序读数及其质量信息。

主要任务: 从Subreads BAM文件生成环状一致性序列（CCS，Circular Consensus Sequencing）。

# 使用pbccs工具生成CCS读数pbccs input.subreads.bam output.ccs.bam --minPasses 3 --minPredictedAccuracy 0.99

参数说明:

• --minPasses: 最少循环次数，确保足够高质量。

• --minPredictedAccuracy: 最低预测准确率（推荐≥0.99）。

---

2. 数据质量评估

检查CCS数据的质量，包括读长分布和质量分数。​​​​​​​

# 使用Bamtools统计基本信息bamtools stats -in output.ccs.bam
# 使用Python脚本绘制读长分布samtools view output.ccs.bam | awk '{print length($10)}' > read_lengths.txt
# 可视化（Python示例）import matplotlib.pyplot as plt
# 读取数据with open("read_lengths.txt") as f:    lengths = [int(line.strip()) for line in f]
# 绘制直方图plt.hist(lengths, bins=50, color='skyblue', edgecolor='black')plt.xlabel("Read Length (bp)")plt.ylabel("Frequency")plt.title("HiFi CCS Read Length Distribution")plt.show()

3. 基因组组装

HiFi测序适用于高质量基因组组装，常用工具包括HiCanu、Flye 和 Hifiasm。

示例：使用Hifiasm进行组装​​​​​​​

hifiasm -o output -t 16 input.ccs.bam

参数说明:

• -o: 输出前缀。

• -t: 使用的CPU线程数。

Hifiasm生成以下文件：

• .p_ctg.fa: 主连锁图（Primary Contigs）。

• .a_ctg.fa: 辅连锁图（Alternate Contigs）。

---

4. 基因组校正

对组装的基因组进行错误校正，提高准确性。使用工具如Pilon或Arrow。

示例：使用Arrow校正​​​​​​​

arrow output.ctg.bam -r assembled_genome.fasta -o polished_genome.fasta

5. 变异检测

高质量的HiFi读长适合用于变异检测，包括点突变（SNV）、插入/缺失（Indel）和结构变异（SV）。

示例：使用DeepVariant检测变异​​​​​​​

# 转换BAM为FASTQsamtools fastq output.ccs.bam > reads.fastq
# 使用DeepVariant进行变异检测run_deepvariant \    --model_type=WGS \    --ref=reference_genome.fasta \    --reads=reads.fastq \    --output_vcf=variants.vcf \    --output_gvcf=variants.g.vcf

6. 结构变异检测

对于结构变异检测（SV），推荐使用pbsv或Sniffles。

示例：使用pbsv检测SV​​​​​​​

# 构建参考索引pbmm2 index reference_genome.fasta reference_genome.mmi
# 比对HiFi读长到参考基因组pbmm2 align reference_genome.mmi output.ccs.bam aligned.bam --sort --preset CCS
# 检测结构变异pbsv discover aligned.bam svs.svsigpbsv call reference_genome.fasta svs.svsig svs.vcf

7. 表观遗传修饰检测

HiFi数据能直接检测DNA甲基化等表观遗传修饰。

示例：使用PacBio的SMRT Link分析甲基化​​​​​​​

# 提取甲基化信号smrtlink analysis-modifications \    --input aligned.bam \    --reference reference_genome.fasta \    --output modifications.csv

8. 可视化结果

使用专用工具查看变异和组装结果。

示例：查看变异和组装​​​​​​​

# 使用samtools索引BAM文件samtools index aligned.bam

9. 数据注释

对变异数据进行功能注释，使用工具如ANNOVAR或SnpEff。

示例：使用SnpEff注释变异​​​​​​​​​​​​​​

java -Xmx4g -jar snpEff.jar GRCh38.99 variants.vcf > annotated_variants.vcf

总结

以上流程涵盖了HiFi测序数据分析的关键步骤，可根据具体需求调整工具和参数。完整工作流程如下：

1. 数据生成与质控：pbccs、bamtools。

2. 组装与校正：hifiasm、arrow。

3. 变异检测：DeepVariant、pbsv。

4. 表观遗传修饰：smrtlink。

5. 注释：SnpEff。

生信大白记第39记，就到这里，关注我！

下一记，持续更新学习生物信息学的内容！

生信大白记邮箱账号：shengxindabaiji@163.com

生信大白记简书账号：生信大白记

生信大白记CSDN账号：生信大白记

生信大白记微信公众号：生信大白记

加入生信大白记交流群938339543