文献阅读：Isoscwles长读长转录组定量方法

介绍

从纳米孔长读序列数据中准确检测和量化mRNA亚型仍然面临着技术噪声的挑战，特别是在单个细胞中。为了解决这个问题，我们介绍了Isosceles，这是一个计算工具包，它在单细胞、伪批量和批量分辨率水平上的亚型检测灵敏度和量化精度方面都优于其他方法，这一点通过使用合成和生物学衍生的数据集得到了证明。在这里，我们展示了Isosceles如何提高单细胞转录组量化在亚型水平上的保真度，并实现了灵活的下游分析。作为一个案例研究，我们应用Isosceles，揭示了在神经分化谱系内部和之间协调的剪接事件。Isosceles适用于不同的生物系统，有助于促进生物医学研究应用中细胞异质性的研究。

出发点：

• 传统的短读RNA-seq技术在覆盖亚型中的大多数外显子-外显子连接方面存在限制，限制了对替代亚型的检测和量化。
• 长读序列技术提供了克服这些限制的机会，允许在批量和单细胞水平上研究全长转录本和复杂剪接事件。
• 然而，长读序列数据的下游分析需要克服低读深度、高基错误率、普遍的截断率和频繁的对齐伪影等挑战。
• 为了解决这些挑战，开发了Isosceles，这是一个用于长读转录组分析的计算工具包，它提供了一种灵活的平衡，既能识别去新转录本，又能过滤掉由于错配引起的剪接伪影。

方法：

• Isosceles使用无环剪接图（acyclic splice-graphs）来表示基因结构，其中节点代表外显子，边表示内含子，路径对应于完整转录本。
• 该方法利用观察到的读段来增强剪接图和转录本集，包括通过去新发现模式增加新的节点和边。
• 读段根据与参考剪接图的兼容性被分类，可以是节点兼容的（使用已知剪接位点）或边兼容的（使用已知内含子），并进一步被分类为截断或全长。
• 使用期望最大化（EM）算法通过转录本兼容性计数（TCC）来获取转录本表达的最大似然估计。
• Isosceles支持多分辨率量化，使用户可以在不同的细胞分组上进行转录本量化，例如基于标记、聚类、伪时间窗口或基于每个细胞的k最近邻。

结论：

• Isosceles在单细胞、伪批量和批量分辨率水平上，相比于其他方法，在亚型检测的灵敏度和量化精度方面表现更佳。
• 使用合成和生物学衍生数据集证明了Isosceles提高了单细胞转录组量化的保真度，并使得下游分析更为灵活。
• 通过应用Isosceles，研究人员揭示了在神经分化谱系内部和之间的协调剪接事件。
• Isosceles适用于不同的生物系统，有助于在生物医学研究应用中研究细胞异质性。

数据和代码

Isosceles R包的代码、文档和示例在GitHub上以开源GPL-3许可证发布，具体链接如下：

• Isosceles R包: https://github.com/Genentech/Isosceles

为了重现手稿中的图表/分析，所有基准测试代码、虚拟环境和量化数据也已发布，具体链接如下：

• 分析代码: https://github.com/Genentech/Isosceles_paper
• Singularity容器: https://doi.org/10.5281/zenodo.8180648
• 基准量化数据: https://doi.org/10.5281/zenodo.8180604
• 原始模拟数据: https://doi.org/10.5281/zenodo.8180695
• 模拟的卵巢癌细胞系批量RNA-Seq数据: https://doi.org/10.5281/zenodo.10895721
• 模拟的卵巢癌细胞系单细胞RNA-Seq数据: https://doi.org/10.5281/zenodo.10895894
• 小鼠E18大脑单细胞RNA-Seq数据: https://doi.org/10.5281/zenodo.10028908