编者按:CUT&Tag,一天完成实验,一周做完研究,革命性技术代替ChIP-Seq势不可挡!
ChIP-Seq是研究细胞内蛋白与DNA互作的重要工具,能在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。然而,由于ChIP的交联作用/免疫共沉淀的局限性,ChIP-Seq实验需要大量细胞,而实验重复性差,低信号、高背景等缺点,往往辛苦培养了很久的细胞,挥霍一空后得到大堆无意义的数据,再次实验又得到不一样的无意义数据……
为了克服ChIP-Seq的缺陷,近岸蛋白质开发了ChiTag酶和CUT&Tag技术。CUT&Tag是一种革命性的新技术,它不需要甲醛交联和免疫共沉淀,即可特异性的将目的蛋白附近的DNA片段直接连上接头并打断,进行高通量测序。该方法可一管式高通量应用,或在单细胞研究中使用。该方法使用了ChiTag酶,可以在打断基因组的同时加上接头,不需要繁琐的补平加A加接头,并且可在一天内完成从细胞到测序文库制备全流程。
CUT&Tag与ChIP-Seq的相同点是都需要使用抗体,特异性结合目的蛋白。不同点在于:ChIP-Seq使用甲醛交联蛋白与DNA,并用超声打断DNA,再免疫共沉淀用ProteinA将抗体富集,这些繁琐的步骤中途会大量损失样本和信息,并造成高背景噪音;而CUT&Tag使用的ChiTag是ProteinA蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白,ProteinA蛋白可在细胞内直接结合抗体(抗体结合在目的蛋白上),连带的Tn5转座酶将切割目的蛋白附近的DNA序列,并将DNA片段连上测序用接头(图1),PCR之后可直接用于高通量测序。
图2 应用实例:低背景高信号的ChiTag
通过实验对比可见使用ChiTag的CUT&Tag方法有更低的背景信号,更好的信号。
此外,CUT&Tag还可以绘制染色质和转录因子结合的活性位点。更重要的是,CUT&Tag能够对极少量细胞(60个细胞)甚至单细胞(操作方法略有改变)进行分析。由于PCR之前的反应都在细胞内进行,Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增的办法,实现单细胞测序(图3)。
CUT&Tag基本流程如下:
1、收集细胞(60-100000个)
2、加入一抗,孵育,加入二抗,孵育
3、加入ChiTag转座体,孵育
4、提取DNA,PCR
5、NGS
CUT&Tag这种革命性的技术将蛋白-DNA研究推进到极低细胞量乃至单细胞,并且拥有更高的信号,更低的噪音,更好的实验重复性,更简洁的操作。这对所有进行表观生物学的研究者是一大福音,并将颠覆性的推动基因修饰及调控的相关研究。