上一期我们谈到了实验分组设计,之后提到了取样和样本量的问题。今天就跟大家聊一聊这两个问题。
样本量设置
怎样的样本量可以证明我们的研究结果具有普适性,更有助于我们发现特征性的规律。这也是我在跟大家交流的时候遇见比较多的问题。
生物学重复,顾名思义,就是同样的实验条件下取不同的样本。这个概念有别于技术重复,后者是在同样实验条件下同一样本分为几份,可以叫做技术重复,主要适用于检测操作稳定性的。而生物学重复旨在验证同一实验条件下的规律性特征。举个例子,比如我们研究肠道样本,同一个实验条件下取三只小鼠的粪便样本分别测量,就是生物学重复;如果只取一只小鼠的粪便,分为三份分别测量,则是技术重复。
那么同一个实验组,多少样本量合适?相信不少老师都有纠结过这个问题。
曾经有个销售小弟很苦恼的跟我说:条姐,我建议客户取五个生物学重复,被骂了,客户说这么大的样本量,说我就是想让他多花钱……心疼销售小弟~ 刚刚说到了生物学重复的问题,那么一定的样本量是必不可少的。建议老师取5个生物学重复就是为了“多掏钱”吗?
基于统计学的原理,三个生物学重复已经是具有统计学意义的最小样本量要求了,那么干嘛要推荐五个呢?
首先,从我们开展研究的统计方法上来讲,很多分析的项目会涉及到诸如t检验、方差分析或秩和检验等,这就需要进行组内的均值或方差、标准差的计算。在没有生物学重复的情况下,计算难以开展,更说不上统计意义了。所以一定数量的生物学重复是很有必要的。
此外,我们知道,微生物组学的研究对象,基本都是环境样本和动植物微生物组样本,这一类样本很容易受到外界环境干扰而产生实验偏差。此前有一位研究花园土壤的老师就遇见过这样的问题,三个生物学重复没问题,但是分析结果出来后,就有一个样本群落结构与另两个样本差异极大,无法实现组内良好的聚类。在重新补送样本之后,这个问题才得到解决——老师剔除了这个“special”的样本。为什么会有这样的问题存在呢?花园是人为活动频繁的区域,所以极可能由于人类活动引起局部土壤微生物群落的巨大变化。
重新送样补测无疑可以解决这一问题,但是资金成本并没有减少,而由此耽误的时间成本也是个问题,所以保守考量,5个生物学重复的建议是不过分的。
那么临床和人体样本,则是另外的建议。如果说环境样本和模式动物实验还便于控制的话,临床样本的干扰因素就太多了。已有报道,人体在不同年龄阶段,不同性别,不同民族及生活习惯,不同生理指标下,微生物组的构成千变万化,所以在研究临床样本时5个生物学重复往往较难得到规律性的结论。
虽然我们一再给大家建议,进行临床样本取样时,尽量把样本筛选条件一致化,比如限定取样人群的年龄性别构成,以及BMI指数一致性等等,但还是有各种各样的因素影响和导致临床样本较大的异质性。所以如果您希望得到较为规律性的结论,还是建议您每组取20-30例以上样本开展相应的研究。
当然,样本量的增加也伴随着成本的升高,目前开展扩增子测序的成本并不高,但是对于宏组学研究,这样的样本量面临的成本压力也是很大的。
这里,条姐倒有个不错的推荐:
先通过低成本的扩增子测序的方法进行样本的筛选,再选择具有代表性的个别样本开展宏组学研究。这样不仅可以节约成本,还可以在此基础上进行多组学的研究和关联分析等,让您的研究立马“高大上”起来。
后续,凌恩会给大家分享一些经典的研究案例,说说微生物组和多组学的研究思路。
相关内容:
微生物组项目设计一
微生物组项目设计二
微生物组项目设计三