本文探讨了在微生物组研究中如何确定合适的样本量，强调了生物学重复与技术重复的区别，并指出至少三个生物学重复具有统计学意义。然而，考虑到环境样本和临床样本的异质性，通常建议5个生物学重复以提高研究的稳健性。对于临床样本，可能需要20-30例以上以获得可靠结论。同时，提出先用低成本扩增子测序筛选样本，再进行宏组学研究的策略，以节约成本并增强研究深度。
上一期我们谈到了实验分组设计，之后提到了取样和样本量的问题。今天就跟大家聊一聊这两个问题。
样本量设置
怎样的样本量可以证明我们的研究结果具有普适性，更有助于我们发现特征性的规律。这也是我在跟大家交流的时候遇见比较多的问题。
生物学重复，顾名思义，就是同样的实验条件下取不同的样本。这个概念有别于技术重复，后者是在同样实验条件下同一样本分为几份，可以叫做技术重复，主要适用于检测操作稳定性的。而生物学重复旨在验证同一实验条件下的规律性特征。举个例子，比如我们研究肠道样本，同一个实验条件下取三只小鼠的粪便样本分别测量，就是生物学重复；如果只取一只小鼠的粪便，分为三份分别测量，则是技术重复。
那么同一个实验组，多少样本量合适？相信不少老师都有纠结过这个问题。
曾经有个销售小弟很苦恼的跟我说：条姐，我建议客户取五个生物学重复，被骂了，客户说这么大的样本量，说我就是想让他多花钱……心疼销售小弟~ 刚刚说到了生物学重复的问题，那么一定的样本量是必不可少的。建议老师取5个生物学重复就是为了“多掏钱”吗？
基于统计学的原理，三个生物学重复已经是具有统计学意义的最小样本量要求了，那么干嘛要推荐五个呢？
首先，从我们开展研究的统计方法上来讲，很多分析的项目会涉及到诸如t检验、方差分析或秩和检验等，这就需要进行组内的均值或方差、标准差的计算。在没有生物学重复的情况下，计算难以开展，更说不上统计意义了。所以一定数量的生物学重复是很有必要的。
此外，我们知道，微生物组学的研究对象，基本都是环境样本和动植物微生物组样本，这一类样本很容易受到外界环境干扰而产生实验偏差。此前有一位研究花园土壤的老师就遇见过这样的问题，三个生物学重复没问题，但是分析结果出来后，就有一个样本群落结构与另两个样本差异极大，无法实现组内良好的聚类。在重新补送样本之后，这个问题才得到解决——老师剔除了这个“special”的样本。为什么会有这样的问题存在呢？花园是人为活动频繁的区域，所以极可能由于人类活动引起局部土壤微生物群落的巨大变化。
重新送样补测无疑可以解决这一问题，但是资金成本并没有减少，而由此耽误的时间成本也是个问题，所以保守考量，5个生物学重复的建议是不过分的。
那么临床和人体样本，则是另外的建议。如果说环境样本和模式动物实验还便于控制的话，临床样本的干扰因素就太多了。已有报道，人体在不同年龄阶段，不同性别，不同民族及生活习惯，不同生理指标下，微生物组的构成千变万化，所以在研究临床样本时5个生物学重复往往较难得到规律性的结论。
虽然我们一再给大家建议，进行临床样本取样时，尽量把样本筛选条件一致化，比如限定取样人群的年龄性别构成，以及BMI指数一致性等等，但还是有各种各样的因素影响和导致临床样本较大的异质性。所以如果您希望得到较为规律性的结论，还是建议您每组取20-30例以上样本开展相应的研究。
当然，样本量的增加也伴随着成本的升高，目前开展扩增子测序的成本并不高，但是对于宏组学研究，这样的样本量面临的成本压力也是很大的。
这里，条姐倒有个不错的推荐：
先通过低成本的扩增子测序的方法进行样本的筛选，再选择具有代表性的个别样本开展宏组学研究。这样不仅可以节约成本，还可以在此基础上进行多组学的研究和关联分析等，让您的研究立马“高大上”起来。
后续，凌恩会给大家分享一些经典的研究案例，说说微生物组和多组学的研究思路。
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微生物组项目设计二
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