凌恩客户文章：ITS测序鉴定耳霉菌病真菌群落

期刊：Frontiers in Microbiology   

影响因子：5.640      

发表时间：2022   

样本类型：外耳道拭子

客户单位：南京中医药大学佘万东课题组

 一、研究背景

耳霉菌病，也称外耳真菌性中耳炎，是由外耳道内致病真菌的入侵或过度传播引起的炎症性病变。本研究通过ITS测序鉴定了耳霉菌病的真菌群落，并评估联苯苄唑的治疗效果。

二、实验设计

在2020年和2021 年期间到江苏省中西医结合医院耳鼻咽喉科就诊的10名患者与健康志愿者10名，真菌病患者每天用联苯苄唑溶液治疗一次，共14天。

在治疗前后（治疗前，n = 14 耳；治疗后，n = 14 耳）采集患者外耳道样本，从 10 名志愿者（对照，n = 20 只耳朵）收集的样品用作对照。记录治疗前及治疗后第7天和第14天的症状，包括耳痒、耳闷、耳痛、听力损失和体征。通过显微镜检查、真菌培养和 ITS 测序，来鉴定病患的真菌群落变化。

三、实验结果

1、联苯苄唑治疗的效果及真菌检测

治疗14天后有效率达到100%，而第7天的有效率为64.29%（表1）。治疗前观察到的外耳道放电减少（图1 A、B），治疗后消失（图1C）。

在预处理组的所有14个样本中都观察到分散的真菌菌丝或孢子（图1D），真菌培养（图1E）和棉蓝染色结果表明是土曲霉。对照组未观察到菌丝或孢子且培养物中无真菌菌落生长。

表1 治疗前后两组症状和体征评分、有效率的比较

图1 电镜检查、真菌培养和显微镜检查

2、真菌群落α多样性与β多样性分析

真菌ITS测序结果表明，与对照组和治疗后组相比，治疗前组观察到的OTU数量显著减少（表2）。此外，治疗前组的Chao1、Shannon和Simpson指数显著低于治疗后组（表2）。这些结果表明，预处理组的真菌物种的丰富度和多样性降低。

表2 三组α多样性参数比较

Bray-Curtis距离的PCoA表明对照组和治疗后组之间没有显著性的区别（图2），但是与对照组和治疗后组相比，预处理组的真菌群落存在差异。

图2  三组真菌成分主坐标分析（PCoA）

3、真菌群落的分类组成

在所有样品中观察到两个主要门：担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）。对照组和治疗后组的担子菌数量比预处理组多，预处理组子囊菌群显著增加。在属水平上，与对照组和治疗后组相比，预处理组中的曲霉更为丰富，对照组和治疗后组马拉色菌更丰富（图3A和表3）。

图3  主要真菌在门和属级别的三个组中的分布

表3  三组真菌群落的主要组成

 4、真菌群落组间差异分析

处理前后样本的真菌群落组成存在显著差异（图4）。在前处理组中，Eurotiales、Eurotiomycetes、Aspergillaceae、Ascomycota和曲霉是差异显著真菌，而在治疗后组中， Nectriaceae 和 Agaricales为差异显著真菌。

图4  真菌群落LEfSe分析

5、真菌与症状和体征的相关性

真菌与症状、体征之间的热图相关性分析表明，曲霉菌属与耳痒、耳胀、听力损失和身体体征相关，而Sagenomella和Libertella与耳痛相关。马拉色菌属与耳痒、耳胀、听力损失和体征呈负相关，而轮枝菌属与耳痒和体征呈负相关（图5）。

图5  真菌丰度与临床因素之间的相关性分析

四、研究结论

在本研究中，作者使用镜检、真菌培养及ITS测序来鉴定真菌病患者的真菌群落组成和差异，提供真菌群落的全面信息，有助于评估抗真菌药物的疗效。Q-PCR、宏基因组或第三代测序技术将有希望应用于更准确地鉴定真菌病中的致病真菌。

参考文献

Identification of the Fungal Community in Otomycosis by Internal Transcribed Spacer Sequencing.Frontiers in Microbiology, 2022.