Visium HD 空间转录组分析探索之--SpaceRanger分析

      10x Genomics Visium 空间转录组是基于完整的组织切片而进行的基因表达无偏检测。该技术通过对置于载玻片上特定捕获区域内的组织切片进行H&E染色和拍照以保留样本的组织形态学信息，然后对样本进行透化处理，将RNA释 放并与捕获区域内的寡核苷酸探针进行杂交，使得不同位点的样本基因信息被SpatialBarcode标记。该技术将基因表达活跃度信息与组织形态学信息结合起来，呈现了组织和基因表达复杂性的新视图。2024年6月，10X公司第一篇 Visium HD的文章在bioRxiv预印，介绍了分辨率可达2 μm， 能实现单细胞分辨率的全转录组空间分析技术Visium HD，以其单细胞分辨率、连续的组织覆盖、高质量的空间数据特性引起了大家的注意。

      为了学习Visium HD数据分析流程，我们准备使用10x官方公布的人结直肠癌样本数据，从原始数据开始，一步步实现文章中的分析结果。我们下载了几个CRC样本测序原始数据、CytAssist导出的组织图像、组织切片的H&E高清图像，公开数据下载地址：https://www.10xgenomics.com/products/visium-hd-spatial-gene-expression/dataset-human-crc

Visium HD技术原理

      Visium HD工作流程类似于v2版本CytAssist支持的Visium空间基因表达工作流程。这个流程将标准的组织学过程与简单的分子生物学方案相结合，在获取组织切片的H&E或IF图像的同时，获取单细胞尺度的全转录组空间基因表达读数。Visium HD已经支持人和小鼠的FFPE、FF样本，样本准备要求与Visium CytAssist（V2）相同。为获得理想的测序数据结果，应确保组织样本的细胞核形态正常、有高质量的RNA以及在实验过程中不会出现脱片等异常情况。Visium HD的实验流程与Visium CytAssist（V2）相同，包括以下主要实验步骤：

（1）样本准备与成像：将FFPE样本切片贴于载玻片有效转片区域内，进行脱蜡、HE染色与图像扫描、脱色和解交联，然后立即进行探针杂交；

（2）探针过夜杂交并清洗后，进行探针连接；

（3）在CytAssist转片仪上完成转片；

（4）将Visium HD玻片置于PCR仪上进行探针延伸；

（5）洗脱并收回探针进行预扩增与文库构建；

（6）高通量测序与数据分析。

Visium HD空间基因表达载玻片包含两个6.5 x 6.5 mm 捕获区域，其中寡核苷酸连续排列在数百万个2 x 2μm正方形中，且芯片无组织间隙，实现单细胞分辨率空间转录组测序的同时达到了全组织覆盖度。数据分析可以以2 μm为最小分辨率，也可以展示多个Bin的分辨率，我们以8x8μm Bin为最小分辨率进行后续分析。

Space Ranger软件安装

软件及参考基因组下载地址：https://www.10xgenomics.com/support/software/space-ranger/downloads

Visium HD图像手动对齐导出对齐参数

Space Ranger虽然有自动图像检测算法来确定基准标记的位置并识别组织边界，但是经常结果不是很理想，所以通常需要Loupe Browser以交互方式将图像与载玻片的基准标记位置对齐，并导出手动对齐参数以在Space Ranger运行中使用。

上传Visium HD CytAssist 图像

填入HD芯片信息，直接导入CytAssist的图像后会自动识别芯片编号和捕获区域

按照提示，校准捕获区域

上传组织H&E高清图像

左右两侧选定对应锚点，一般3~5个左右即可

导出对齐参数json文件，该文件后续Space Ranger分析时需要传入

Space Ranger分析

spaceranger count \
	--id=P1_CRC \
	--transcriptome=/database/refdata-gex-mm10-2020-A \
	--fastqs=/home/data/Visium_HD_Human_Colon_Cancer/fastq \
	--sample=P1_CRC \
	--image=/home/data/Visium_HD_Human_Colon_Cancer/images/Visium_HD_Human_Colon_Cancer_image.tif \
	--slide=H1-VM2JXXK \
	--area=A1 \
	--localcores=32 \
	--localmem=64 \
	--create-bam false \
	--probe-set=/home/software/spaceranger-3.0.0/probe_sets/Visium_Mouse_Transcriptome_Probe_Set_v2.0_mm10-2020-A.csv \
	--cytaimage=/home/data/Visium_HD_Human_Colon_Cancer/images/Visium_HD_Human_Colon_Cancer_tissue_image.btf \
	--loupe-alignment=/home/data/H1-VM2JXXK-A1-fiducials-image-registration.json

Space Ranger完成后生成结果文件夹

Space Ranger输出文件结构

binned_outputs文件夹内默认生成了2um,8um,16um bin的结果，Spaceranger v3.1版本后可以自定义生成2-100um的偶数bin，同时也会生成相应的cloupe文件，之前版本只会生成8um bin的cloupe文件。我们使用10x文章中推荐的8x8um bin进行后续分析。

web_summary结果

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