RPKM、 FPKM、TPM、CPM

一、什么是RPKM、 FPKM、TPM、CPM
RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!
对基因counts进行校正定量一般有RPKM、FPKM 、TPM和CPM这几种方法，StatQuest网站中对RPKM, FPKM 和 TPM作了通俗简要的说明，现将其核心要点整理如下：
RPKM
RPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped)
每千个碱基的转录每百万映射读取的reads
计算RPKM的方法：
1.计算样本中的总reads，并将该数字除以1,000,000——这是我们的“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor )。
2.将reads数除以“每百万”缩放因子。消除测序深度影响，得到每百万reads（RPM, reads per million）
3.将RPM值除以基因长度（以千碱基为单位），消除基因长度影响，得到RPKM。
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FPKM
FPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments
FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的，其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq，两个reads可以对应一个片段（Fragment）。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段（因此它不会对该片段进行两次计数）。
即 单端测序：reads=fragments，双端测序：2 * reads≈fragments
而经过上游处理，双端测序两个reads可以对应一个片段的过程已经完成，最后得到的counts就已经相当于是片段fragments了，因此下游分析由counts计算RPKM、 FPKM这两者的公式完全一致。
TPM
TPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads)
每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts
计算TPM的方法：
1.将读数计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位），得到每千碱基reads（RPK, reads per kilobase）。
2.计算样本中所有RPK值，然后将其除以1,000,000，得到“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor )。
3.将RPK值除以“每百万”缩放因子，得到TPM。
因此在计算TPM时，与RPKM、 FPKM相比，唯一的区别是TPM先对基因长度进行标准化，然后对测序深度进行标准化。但是，这种差异的影响非常深远。因为使用TPM时，每个样本中所有TPM的总和是相同的，这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的读数的比例。相反，使用RPKM和FPKM，每个样本中的标准化读数之和可能会有所不同，这使得直接比较样本变得更加困难。

我对比了一下TPM与FPKM RPKM。可以推算一下，TPM最后每个样本的基因读数总和都是一样的，但FPKM RPKM每个样本的基因读书不一定相等，这就令样本间基因的比较变得困难。

因此还是拿TPM来比较好点

https://zhuanlan.zhihu.com/p/425391789
https://www.cnblogs.com/wangprince2017/p/9813376.html

CPM
CPM（Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads） 每百万映射读取的counts
除了RPKM、 FPKM、TPM这几种方法，CPM也是较为常见的一种基因定量方式。原始的表达量除以该样本表达量的总和，再乘以一百万，即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化，一般利用edgeR包的cpm()函数即可对基因counts进行简单校正 。
edgeR::cpm(counts)
二、由Counts计算FPKM/RPKM和TPM
有许多文章已经给出了这几种计数方式的计算和转化关系，如What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)。

为了更清楚直观地明白FPKM/RPKM和TPM的计算过程，根据StatQuest定义给出的计算方法，自己重新写了由counts转化为FPKM/RPKM和TPM的计算公式代码，经过验证其结果与上面公式所得结果一致，那今后就用自己写的这些代码吧，具体代码如下：

要注意一点的是计算FPKM/RPKM和TPM时，基因长度一般指的都是基因的有效长度effective length，即该基因的外显子总长度或转录本总长度，以此为标准来消除测序造成的基因长度影响才更为准确。

参考资料：RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)RPKM、FPKM、TPM详解RNA-seq的counts值，RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)