Seurat | 强烈建议收藏的单细胞分析标准流程（差异分析与细胞注释）（五）

1写在前面

本期我们介绍一下如何使用Seurat包进行差异分析，以及如何使用SingleR进行细胞注释。😘

2用到的包

rm(list = ls())
library(Seurat)
library(tidyverse)
library(SingleR)
library(celldex)
library(RColorBrewer)
library(SingleCellExperiment)

3示例数据

这里我们还是使用之前建好的srat文件，我之前保存成了.Rdata，这里就直接加载了。🧐

load("./srat2.Rdata")
srat

4差异分析

首先要和大家说的是，尽量使用counts进行差异分析，而不是你SCTransform等操作后的数据。😉
我们先将assy还原回原始矩阵吧，进行一下过滤。🤜

4.1 初步处理

DefaultAssay(srat) <- "RNA"
srat <- NormalizeData(srat)
srat <- FindVariableFeatures(srat, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
all.genes <- rownames(srat)
srat <- ScaleData(srat, features = all.genes)

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4.2 计算所有marker

all.markers <- FindAllMarkers(srat, only.pos = T, min.pct = 0.5, logfc.threshold = 0.5)

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4.3 Top3

接着我们看看各个Cluster的top3基因是什么。

top3_markers <- as.data.frame(all.markers %>% group_by(cluster) %>% 
                                top_n(n = 3, wt = avg_log2FC))
top3_markers

5细胞注释

5.1 手动注释

通过上面找到的基因，结合我们通过文献、数据库等可以成功注释细胞的类型。🤗 有的小伙伴就会说了：那不就是手动注释了吗！？🧐

是的，其实目前最准确的注释方法就是手动注释，提供一个我个人常用的数据库（CellMarker）: 👇
http://xteam.xbio.top/CellMarker/

5.2 自动注释

这里我们先将Seurat转成SingleCellExperiment，方便后续操作。😘

sce <- as.SingleCellExperiment(DietSeurat(srat))
sce

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5.3 背景文件

背景文件我们使用celldex包的数据，大家根据自己的需要选择就行了。😘
Note! 这个文件里会有两种类型，label.main和label.fine，我们后面都使用一下吧。

monaco.ref <- celldex::MonacoImmuneData()
# hpca.ref <- celldex::HumanPrimaryCellAtlasData()
# dice.ref <- celldex::DatabaseImmuneCellExpressionData()

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5.4 SingleR

常用的自动注释包，包括signleR, Cellassign等。🥳
这里我们用SingleR试一下吧。👀

monaco.main <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = monaco.ref,labels = monaco.ref$label.main)
monaco.fine <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = monaco.ref,labels = monaco.ref$label.fine)
# hpca.main <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = hpca.ref,labels = hpca.ref$label.main)
# hpca.fine <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = hpca.ref,labels = hpca.ref$label.fine)
# dice.main <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = dice.ref,labels = dice.ref$label.main)
# dice.fine <- SingleR(test = sce,assay.type.test = 1,ref = dice.ref,labels = dice.ref$label.fine)

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5.5 查看结果

table(monaco.main$pruned.labels)
table(monaco.fine$pruned.labels)

#table(hpca.main$pruned.labels)
# table(hpca.fine$pruned.labels)
#table(dice.main$pruned.labels)
# table(dice.fine$pruned.labels)

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5.6 添加信息

srat@meta.data$monaco.main <- monaco.main$pruned.labels
srat@meta.data$monaco.fine <- monaco.fine$pruned.labels

# srat@meta.data$hpca.main   <- hpca.main$pruned.labels
# srat@meta.data$dice.main   <- dice.main$pruned.labels
# srat@meta.data$hpca.fine   <- hpca.fine$pruned.labels
# srat@meta.data$dice.fine   <- dice.fine$pruned.labels

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5.7 可视化

srat <- SetIdent(srat, value = "monaco.fine")

ncluster <- length(unique(srat[[]]$monaco.fine))

mycol <- colorRampPalette(brewer.pal(8, "Set2"))(ncluster)

DimPlot(srat, 
        label = T , repel = T, 
        label.size = 5,
        cols = mycol) + 
  NoLegend()

6简单验证

我们简单验证一下注释效果，用几个已知marker看一下吧，已知：👇

• plasma B, CD38和 CD59;
• MAIT cells, CD161 (KLRB1)和 CXCR6。

6.1 plasma B

FeaturePlot(srat,c("CD38","CD59"),
            label = T, repel = T) 

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6.2 MAIT cells

FeaturePlot(srat,c("KLRB1", "CXCR6"),
            label = T, repel = T)

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最后祝大家早日不卷!~

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需要示例数据的小伙伴，在公众号回复Seurat获取吧！

点个在看吧各位~ ✐.ɴɪᴄᴇ ᴅᴀʏ 〰

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