【软件介绍】IGV软件的安装和基本介绍

IGV（Integrative Genomics Viewer）是一个高性能的可视化工具，可以交互式的察看综合的基因组相关数据，友好的支持多种数据类型，包括芯片、二代测序和基因组注释数据等。IGV是基于Java的工具，且在不断更新当中，不同版本的IGV可能需要不同的Java版本。

1. IGV 下载与安装

IGV 有Windows、MAC和Linux系统对应的版本，下载网址为：http://software.broadinstitute.org/software/igv/download。
本文以 Windows (64 位) 系统为例进行介绍。安装好IGV后，可以查看安装目录下的readme.txt 文件，以确定所需的Java版本。IGV 2.10.3 版本需要Java 11，且与Java 8，9，10版本不兼容。

2. Java 安装及环境变量设置

查看电脑上已安装的Java版本：

可见，已安装的为Java 8，需重新安装并配置Java 11。由于是二进制版本，因此不需要安装，解压后，配置环境变量即可使用。
Java 11 二进制版本的下载地址：https://download.java.net/java/GA/jdk11/9/GPL/openjdk-11.0.2_windows-x64_bin.zip。

下载目录：

环境变量设置：
(1) 新建JAVA_HOME变量，并且输入JDK11的安装目录。
(2) 编辑Path变量把%JAVA_HOME%\bin;这个变量插入。

通过cmd窗口验证jdk11是否安装成功：

双击igv.bat文件（有时需鼠标右键以管理员身份运行），即可打开IGV。打开IGV时，会调用windows的cmd面板。

3. IGV 基本介绍

3.1 IGV 界面布局

官方示例：http://software.broadinstitute.org/software/igv/MainWindow

① 工具栏：基因组列表区、染色体列表区、检索区（可填入基因名，基因组位置等信息来定位到具体基因组区段）、工具区（依次为返回至整个基因组视角，后退一步操作，前进一步操作，刷新，选取特定区域，缩放至屏幕大小，track 信息展示方式）、缩小和放大视野。
② 染色体：染色体上的红框表示为显示在当前track上的相应区域，当缩小到显示完整的染色体时，红色方框消失。
③ 刻度线表示所处的染色体位置坐标，span列出当前显示的碱基数量（244 bp）。
④ tracks区域：主要的信息区，通常会显示甲基化、基因表达、拷贝数、杂合性缺失（Loss of Heterozygosity）、突变等信息；对应的有三种显示形式：collaspsed（堆积）、squished（压缩）和expanded（展开）。
⑤ 特征显示区：如，基因。蓝色粗线为外显子区域，细线为内含子区域，空白为基因间隙；
⑥ track 名称区：列出 track名称，即导入的比对等结果名称，一个文件就是一个 track。

其他示例：

James T. Robinson, Helga Thorvaldsdóttir, Wendy Winckler, Mitchell Guttman, Eric S. Lander, Gad Getz, Jill P. Mesirov. Integrative Genomics Viewer. Nature Biotechnology 29, 24-26 (2011).

Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013 Mar;14(2):178-92.

3.2 IGV 结果界面

①可手动输入想要察看的染色体/基因/contigs/scaffolds编号/位点（如，chr5:90,339,000-90,349,000；DPYD或NM_10000000），然后回车查看；
②参考序列对应的核酸序列，其中四种核酸分别用不同的颜色表示：A绿, C蓝, G橙, T红，下面为对应翻译的氨基酸序列，甲硫氨酸（M）用绿格表示，终止密码子（*）星号红格表示；当右上角的标尺足够大时此区域才会显示；在sequence track中有一个向右的小箭头，点击小箭头方向变为向左，此时获得的是参考基因的反向互补序列。
③不同颜色条表示排序方式，鼠标停留在此处右键选择 <Color alignments by> 可选取不同的颜色形式；同时每一个长条对应的序列和比对信息可以鼠标右键选择来拷贝；每一个长条都是由一系列的核酸序列组成，可通行<Show all bases> 来显示；比对的reads长条也可通过成对的形式显示；
④鼠标停留时会显示此处碱基统计信息；当导入数据为比对的bam数据时，此处所在区域为 Coverage Track。

3.3 序列比对结果说明

IGV使用颜色、透明度和其他的标记来显示SNV变异、插入和删除/缺失等。
(1) 可通过 View ->Preferences ->Alignments 面板设置相关参数；
(2) 在 Track 区不进行 Color alignments by 的情况下，alignments 只有亮灰和白色两种长条，其中灰色为与参考基因能比对上的reads，白色的比对质量为零 (mapping quality equal to zero)；
(3) 插入：用紫色或红色的 I （当插入的碱基数多余预设的阀值时）表示；鼠标停留察看详细的插入碱基情况；
(4) 删除/缺失：黑色横线——表示；
(5) Sort alignments by 可对Track区域进行排序，如想返回最初结果则选择 Re-pack alignments 即可；
(6) 默认情况下 Track Alignments 区以紧凑的单个 reads 的形式展示，通过 View as pairs 可成对显示；
(7) Paired-end alignment tracks (View as pairs) 时，将reads以pairs形式和颜色来区分（红色-负链，蓝色-正链）；右键选择 View mate region in split screen 可以分为几个屏幕显示；右键选择 Switch to standard view 可返回单个分区。

注：颜色等标注详解见，
Viewing Alignments：http://software.broadinstitute.org/software/igv/AlignmentData
Interpreting Color by Insert Size：http://software.broadinstitute.org/software/igv/interpreting_insert_size
Interpreting Color by Pair Orientation：http://software.broadinstitute.org/software/igv/interpreting_pair_orientations
Interpreting Color by Bisulfite Mode：http://software.broadinstitute.org/software/igv/interpreting_bisulfite_mode

4. 文件格式说明

IGV支持多种文件格式 http://software.broadinstitute.org/software/igv/FileFormats：BAM、BED、BEDPE、BedGraph、bigBed、bigWig、Custom File Formats、Cytoband、FASTA、GCT、CRAM、genePred、GFF/GTF、GISTIC、Goby、GWAS、IGV、LOH、MAF (Multiple Alignment Format)、MAF (Mutation Annotation Format)、Merged BAM File、MUT、narrowPeak、PSL、RES、RNA Secondary Structure Formats、SAM、Sample Info (Attributes) file、SEG、TDF、Track Line、Type Line、VCF、WIG 等。

当数据通过 File-> load from file 导入时，IGV通过导入文件的扩展名来确认数据格式 (file format)，进而确定数据类型 (data type)，再确定数据展现的 Track 形式 (track default display options)。

4.1 FASTA 文件

FASTA文件是一个文本文件，每个序列以单行描述开始，后面跟着几行序列数据，用于指定导入基因组的参考序列。
详见：NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[1] - fasta和fastq格式

导入：可以在工具栏选择参考基因组；也可以通过菜单栏选择Genomes -> Load Genomes From Files 从本地以及服务器(server)中导入参考基因组。
IGV服务器上有多个基因组：http://software.broadinstitute.org/software/igv/Genomes

4.2 BAM 文件

官方说明：http://software.broadinstitute.org/software/igv/BAM；http://software.broadinstitute.org/software/igv/merged_BAMs

命名原则：IGV要求sam和bam文件都按位置进行排序（sort）和建索引（index），并且索引文件遵循特定的命名约定，这两步骤可以用samtools或Picard软件实现（NGS数据分析实践：06. 数据预处理 - 序列比对+PCR重复标记+Indel区域重比对+碱基质量重校正）。bam索引文件应该通过在bam文件名后附加. bai来命名。sam索引文件应该通过在sam文件名后附加. sai来命名。bam文件(.bam)是sam文件的二进制版本。IGV的推荐格式是bam，而不是sam。命名示例：test-xyz.bam 的索引文件需被命名为test-xyz.bam.bai或test-xyz.bai。

多个bam文件：若需将多个bam文件合并到一个track进行展示，则需要创建一个纯文本文件，文件名需以.bam.list.txt结尾。文件中需列出每个bam文件的路径或者URL，且该路径下有相应的索引文件 (.bai)。注：较老版本的IGV，创建的txt纯文本文件中不能有末尾空行。

导入：通过File -> Load from File导入本地bam文件至IGV。

Tracks：载入bam文件后会产生3个相关的tracks，①Alignment track显示每个的reads的比对情况；②Coverage track显示覆盖度和测序深度；③Splice Junction Track提供一个可选的横跨剪切位点(spanning splice junctions)的reads视图（http://software.broadinstitute.org/software/igv/splice_junctions）。一般情况下，前两个tracks会自动出现。这些设置可以通过右键进行修改。默认情况下，IGV能动态计算和显示比对文件的覆盖率和测序深度。当IGV窗口放大到reads 可视化阈值大小时，这个track会以灰色条形图显示每个位点的测序深度。如果某核苷酸与参考序列不同（超过20%reads）时，IGV会标出不同的颜色。即：A→绿色；C→蓝色；G→橙色；T→红色。将鼠标悬停在你需要查看的位点处可以看到详细的信息，右键可以复制。

注：
(1) 染色体名称：所选参考基因组的染色体名称与bam文件需一致。为了方便，IGV将两种染色体表示方式等同起来，如，染色体 1和chr1是等价的。
(2) 1-based index：开始和结束位置使用基于1的索引来标识。终点位置包括在内。例如，将start-end设置为1-2表示序列中的第一个和第二个碱基。

4.3 TDF 文件

官方说明：http://software.broadinstitute.org/software/igv/TDF；http://software.broadinstitute.org/software/igv/igvtools
Reads 覆盖率：整体视图，默认的覆盖率视图，和扩展覆盖率视图。可用igvtools将BAM文件转化为TDF格式，这个文件是专门显示覆盖率，方便快速查看。

4.4 bw文件

bam文件很大，不方便查看和转移。而有些时候，只需要测序深度这一个值，并不需要具体某条reads的碱基序列，碱基质量值。因此，可以把bam格式转化为bw格式，以查看测序深度分布。bw格式全称是bigwig格式，规定了数据的每个坐标区间的测序深度。详见，NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[4] - bed和Wiggle/Bigwig/bedgraph格式。

利用deeptools这个软件的bamCoverage工具来完成bam到bw的转换：

source ~/anaconda3/bin/activate
conda activate SNPseq
conda install deeptools -y
bamCoverage --binSize 25 -b 20180629001.sorted.bam -o 20180629001.sorted.bw
ll -h *.bw

4.5 GFF/GTF文件

GFF (General Feature Format) 文件是一个简单的制表符分隔文本文件，用于描述基因组特征。有几种不同的 GFF 文件格式。IGV 支持 GFF2、GFF3 和 GTF 文件格式。详见：http://software.broadinstitute.org/software/igv/GFF。
GFF2在IGV中的文件扩展名，必须是.gff。
GFF3在IGV中的文件扩展名，必须为.gff3，格式描述详见 http://www.sequenceontology.org/gff3.shtml。
GTF在IGV中的文件扩展名，必须为.gtf，格式描述见 https://mblab.wustl.edu/GTF2.html。
1-based index：开始位置和结束位置均是从1开始的，如，将start-end设置为1-2，则表示序列中的第1和第2个碱基。
颜色特征：要为给定特征指定颜色，可以将其添加到文件中，如下例所示。颜色值可以是十六进制或 RGB (r, g, b) 格式。

##gff-version 3
chr1 varclass variants_454HCDiffs 59133 59133 33 . . Var=A->G;AA=S->S;depth=9;frame=+1;gene=OR4F5;ref=novel;InRegion;color=#0000EE
chr1 varclass variants_454HCDiffs 59374 59374 67 . . Var=A->G;AA=T->A;depth=30;frame=+1;gene=OR4F5;ref=rs2691305;InRegion;color=#EE0000
chr1 varclass variants_454HCDiffs 731442 731442 100 . . Var=T->C;AA=->;depth=3;frame=;gene=;ref=rs3115865,rs61770168;OutOfRegion;color=#AAAAAA

4.6 VCF文件

VCF 代表 Variant Call Format，1000 Genomes 项目使用它来编码结构遗传变异。官方说明见，http://software.broadinstitute.org/software/igv/VCF。有关突变和 VCF 文件的 IGV 可视化示例见：http://software.broadinstitute.org/software/igv/viewing_variants。变异识别包括：SNPs，indels和基因组重排。样本也可以注释属性信息，包括血统、家系等。IGV 使用这些注释对样本进行分组、排序和过滤，例如按人口组对样本进行分组。

需要的扩展名包括：.vcf或 .vcf.gz，如果文件进行了gzip压缩，那么还需要相应的tabix (.tbi)格式的索引文件。该文件可以利用bcftools等工具生成，也可以使用IGV Tools生成（Tools->Run igvtools...），http://software.broadinstitute.org/software/igv/igvtools。

bcftools index -t bacth1_test2.bcftools.vcf.gz
# bacth1_test2.bcftools.vcf.gz.tbi

为VCF文件track载入相应的BAM track： 可使用 2 列制表符分隔的mapping文件将 BAM 文件与 VCF 文件中的样本相关联。文件名必须是.mapping，其实就是将 .mapping 添加到 vcf 文件名的末尾。第1列是来自 vcf 文件的样本名称；第2列是指向 bam 文件的路径，可以是 URL 或文件路径；它可以是绝对路径，也可以是相对于 vcf 文件所在位置的路径。如果存在mapping文件，它将自动加载，并且 VCF track中将出现一个名为load alignments的新菜单项。

VCF文件格式数据详解见：NGS数据分析实践：03. 涉及的常用数据格式[5] - vcf格式 和 v4.2 specifications：http://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf。

结果图形展示：
VCF Files：http://software.broadinstitute.org/software/igv/viewing_vcf_files
Multi-Locus View：http://software.broadinstitute.org/software/igv/multilocus_view
Regions of Interest：http://software.broadinstitute.org/software/igv/regionsofinterest

4.7 GWAS文件

GWAS 文件是来自全基因组关联研究分析的空格或制表符分隔的结果文件。这些文件包括整合map信息（即每个关联的染色体位置）的 PLINK 结果文件。GWAS 文件的扩展名有：.linear、.logistic、.assoc、.qassoc、.gwas。

GWAS 文件必须包含一个标题行和四个必需的列（不区分大小写）：
① CHR: chromosome (aliases chr, chromosome)；
② BP: nucleotide location (aliases bp, pos, position)；
③ SNP: SNP identifier (aliases snp, rs, rsid, rsnum, id, marker, markername)；
④ P: p-value for the association (aliases p, pval, p-value, pvalue, p.value)
列可以按任何顺序排列，除必需列外的其他列是允许的。p 值将转换为 -log10 尺度进行绘图。

结果图形示例：http://software.broadinstitute.org/software/igv/viewing_gwas。

参考阅读：
(1) Java11安装及环境变量设置：https://blog.csdn.net/sihai12345/article/details/83834201
(2) windows IGV下载和常见的打开报错原因：https://www.jianshu.com/p/5cde024fac50
(3) IGV User Guide：http://software.broadinstitute.org/software/igv/UserGuide
(4) 生信技能树，学IGV必看的初级教程
(5) 生信技能树，使用IGV看序列比对情况
(6) 生信技能树，【直播】我的基因组 35：bam格式转化为bw格式看测序深度分布
(7) 必备可视化Integrative Genomic Viewer(IGV)(一)
(8) 必备可视化Integrative Genomic Viewer(IGV)(二)
(9) 基因组数据可视化：IGV软件使用详解
(10) 眼到手到-IGV的高级实操
(11) 3篇10分用户文章教你如何将m6A-seq和RIP-seq结果一起可视化 | m6A专题
(12) NGS 测序深度和覆盖度—Depth、Coverage
(13) 测序深度和覆盖度综述：基因组学分析的关键参数