Ka/Ks介绍和分析

什么是Ka/Ks?

在遗传学中，Ka/Ks表示的是两个蛋白编码基因的非同义替换率（Ka）和同义替换率（Ks）之间的比例。这个比例可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因。

如果你手头有两个不同物种的同一个基因的序列，比如人和小鼠的p53基因，然后把这两个基因的序列进行比对，你会发现这两段序列有差异（进化！）。再仔细观察，你会发现有些碱基的变化导致了编码氨基酸的变化（非同义替换），有些没有导致编码氨基酸的变化（同义替换）。这是由密码子的简并性造成的，因为3个碱基决定1个氨基酸，所以64种碱基组合决定20种氨基酸，会有冗余出现。一般情况下，第三个碱基变化会造成同义替换，而第一二个碱基的变化会非造成同义替换。

Ka和Ks的计算公式：
Ka=发生非同义替换的SNP数/非同义替换位点数
Ks=发生同义替换的SNP数/同义替换位点数
其中同义替换位点数就是不会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸（ser）的第三位碱基。而非同义替换位点数就是会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸（ser）的第一二位碱基。对于像第一个方框里面的苯丙氨酸（phe）和亮氨酸（leu）这种情况，第三位碱基的变化只是有可能造成氨基酸的变化，也就是两种不同的氨基酸各占了两个碱基的位点，则在计算非同义替换位点数和同义替换位点数时，各加上1/2，相当于两者平分了这个位点。另外，计算Ka/Ks时，不考虑start codon和stop codon。
好了，现在我们回到上面的人和小鼠的p53基因的例子。我们只需要数一下两个序列发生（非）同义替换的SNP位点数，再除以（非）同义替换位点数，就得到了Ka和Ks值，然后就可以计算Ka/Ks ratio。

上面的计算方法并没有考虑不同碱基之间发生替换的速率的不同，比如，嘌呤之间替换的概率（A=>G）要高于嘌呤替换为嘧啶的概率（A=>C或T），也就是说转换（transition，嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶）发生的概率要高于颠换（transversion，嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤）发生的概率。很多计算方法都会考虑到这些替换发生概率的不同。
另外，两个物种分化时间的长短也会影响到Ka/Ks的比值。比如有一个位点，原来是A，后来变成了T，再后来又变成了C，虽然发生了两次替换，但最后仅有一次替换被用于计算替换率。再比如有一个位点，原来是A，后来变成T，但同时与它相对应的另一个序列的位点，也发生了A到T的替换，那么我们也是无法用上面的方法来计算替换率。对于这种复杂的情况，我们可以用最大似然法来计算最可能的替换率，这里不再详述。

那么Ka/Ks和进化有什么关系？

细心的小伙伴可能已经看出来了，在上面的密码子表中，同义替换位点比较少。实际上一个基因中大概只有25%的位点是同义替换位点。假设这个基因没有受到自然选择压力，那么根据中性选择理论，非同义替换率和同义替换率应该是相同的。
一般来讲，因为非同义替换会造成氨基酸变化，可能会改变蛋白质的构象和功能，因此会造成适应性的变化，从而带来自然选择的优势或劣势（一般是劣势）。而非同义替换没有改变蛋白质的组成，因此不受自然选择的影响（当然这里我们忽略密码子偏好性的影响），那么Ks就能反映进化过程的背景碱基替换率。Ka/Ks的比值就能说明这个基因是受到了何种选择。

长颈鹿的长脖子基因肯定是受到了正选择…

一般情况下，在某个个体中偶然发生的一个碱基替换（突变），如果没有额外的好处或者坏处的话，慢慢地也就消失了。但是自然选择中会有很多巧合，某些突变就是很幸运地被保留了下来，并且被固定了（突变频率由极小变为100%）。一个这样的突变在一个二倍体种群中被固定的可能性为1/2N，其中N是种群大小。
对于一个没有受到自然选择压力的基因来说，我们可以计算得到这样的结果：Ka/Ks=1。但实际情况下，这个比值都是远小于1的：Ks/Ks<<1，因为一般非同义替换带来的都是有害的性状，只有极少数情况下会造成进化上的优势。

于是，我们有了下面的分类：
Ka>>Ks或者Ka/Ks >> 1，基因受正选择(positive selection)
Ka＝Ks或者Ka/Ks=1，基因中性进化(neutral evolution)
Ka<<Ks或者Ka/Ks << 1，基因受纯化选择(purify selection)

KaKs分析方法

1. 可以使用Kaks_calculator2.0计算 KaKs

1. 下载地址：https://udomain.dl.sourceforge.net/project/kakscalculator2/KaKs_Calculator2.0.rar
   输入文件为axt格式，具体要求如下example.axt：
   
   文件总共三行，第一行使配对基因或同源基因的名字，后面是两个比较物种的基因序列。

2. 运行脚本：

/biodata/02.software/KaKs_Calculator2.0/bin/Linux/KaKs_Calculator -i example.axt -o example.axt.kaks -m GMYN

2. 使用ParaAT套件分析KaKs

1. 下载地址：https://download.cncb.ac.cn/bigd/tools/ParaAT2.0.tar.gz

准备输入文件：

• test.homologs： 同源基因对儿
• test.cds： 同源基因对儿的cds序列
• test.pep：同源基因对儿的pep序列
• proc：线程数

以上文件均可在ParaAT文件夹中找到，可做参考。
比对参数推荐使用muscle，速度快，效果好。

2. 运行脚本：

ParaAT.pl -h test.homologs -n test.cds -a test.pep -p proc -m muscle -f axt -g -k -o result_dir

• -h, 同源基因名称文件
• -n, 指定核酸序列文件
• -a, 指定蛋白序列文件
• -p, 指定多线程文件
• -m, 指定比对工具
• -g, 去除比对有gap的密码子
• -k, 用KaKs_Calculator 计算kaks值
• -o, 输出结果的目录
• -f, 输出比对文件的格式
• *** 也可通过-f参数得到其他软件分析ka/k所需的格式

参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/144271268?utm_id=0