（单细胞-SingleCell）Scanpy流程——python 实现单细胞 Seurat 流程——单细胞文献实战

最新推荐文章于 2023-05-23 23:35:04 发布

TTS56

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分类专栏：单细胞单细胞与深度学习

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单细胞与深度学习

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导入模块

import scanpy as sc
import os
import math
import itertools
import warnings
import numpy as np
import pandas as pd
import matplotlib.pyplot as plt
%matplotlib inline
%config InlineBackend.figure_format = 'svg'
warnings.filterwarnings("ignore")
plt.rc('font',family='Times New Roman')
my_colors = ["#1EB2A6","#ffc4a3","#e2979c","#F67575"]

sc.settings.verbosity = 3  # 输出提示信息         
# ?sc.settings.verbosity
sc.logging.print_header()
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white')# 设置输出图像格式
results_file = 'write/pbmc3k.h5ad'  # 存储分析结果

scanpy==1.6.0 anndata==0.7.5 umap==0.4.6 numpy==1.19.2 scipy==1.4.1 pandas==1.1.3 scikit-learn==0.23.2 statsmodels==0.12.0

这里的读取文件的方式和R语言构造seurat对象基本一样（按照官网分类有12中读取方式）
下面主要介绍两种方法
第一种方法是，文件下面要有3个初始文件包括：

barcord
genes
matrix
然后使用输 sc.read_10_mtx 读取

第二种方法是直接构建AnnData对象
然后分别的将表达矩阵，细胞信息，基因信息读取，代码如下

# 这个是第二种方法
#adata = sc.AnnData(counts.values, obs=cellinfo, var=geneinfo)
#adata.obs_names = cellinfo.Cell
#adata.var_names = geneinfo.Gene
#sc.pp.filter_genes(adata, min_counts=1)
#adata

# 这个是第一种读取方法
adata = sc.read_10x_mtx(
    './filtered_gene_bc_matrices/hg19/',  # the directory with the `.mtx` file
    var_names='gene_symbols',                # use gene symbols for the variable names (variables-axis index)
    cache=True) 
adata.var_names_make_unique()
adata

tips: pytho和R语言有点不同，通常情况下，行为样本，列为特征

adata.obs.shape # 2700个细胞
adata.var.shape # 32738个基因
adata.to_df().shape # 2700*32738
adata.obs.head()
adata.var.head()
adata.to_df().iloc[0:5,0:5]

数据预处理

这里介绍一下scanpy中常用的组件

pp: 数据预处理
tl: 添加额外信息
pl：可视化

统计基因在细胞中的占比并可视化

sc.pl.highest_expr_genes(adata, n_top=20) # 每一个基因在所有细胞中的平均表达量（这里计算了百分比含量）
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200) # 每一个细胞至少表达200个基因
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3) # 每一个基因至少在3个细胞中表达

normalizing counts per cell
    finished (0:00:00)

png

过滤线粒体DNA

adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')
adata.var['mt'].head()

# 抽取带有MT的字符串
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-') 
# 数据过滤
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], percent_top=None, log1p=False, inplace=True)
# 过滤后可视化（官方文档真的骚到我头皮发麻）
sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts'],jitter=0.4)
sc.pl.violin(adata, ['total_counts'],jitter=0.4)
sc.pl.violin(adata, ['pct_counts_mt'],jitter=0.4)

png

sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='pct_counts_mt')
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='n_genes_by_counts')

png

# 提取线粒体dna在5%以下
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]
# 提取基因不超过2500的细胞
adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts < 2500, :]

标准流程：

log : NormalizeData
找特征 : FindVariableFeatures
标准化 : ScaleData
pca : RunPCA
构建图 : FindNeighbors
聚类 : FindClusters
tsne /umap : RunTSNE RunUMAP
差异基因 : FindAllMarkers / FindMarkers

sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4) # 不要和log顺序搞反了 ，这个是去文库的
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)
# 可视化
sc.pl.highly_variable_genes(adata)
# 保存一下原始数据
adata.raw = adata

png

# 提取高变基因
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]
# 过滤掉没用的东西
sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts', 'pct_counts_mt'])
# 中心化
sc.pp.scale(adata, max_value=10)
# pca
sc.tl.pca(adata, svd_solver='arpack')
sc.pl.pca(adata, color='CST3')
sc.pl.pca_variance_ratio(adata, log=True)
# 输出结果
adata.write(results_file)

png

# 构建图
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40)
sc.tl.umap(adata)
sc.pl.umap(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'])
sc.pl.umap(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'], use_raw=False)

sc.tl.tsne(adata)
sc.pl.tsne(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'])
sc.pl.tsne(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'], use_raw=False)

png

sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40)
sc.tl.leiden(adata)
sc.pl.umap(adata, color=['leiden', 'CST3', 'NKG7'])
sc.pl.tsne(adata, color=['leiden', 'CST3', 'NKG7'])
# 保存结果
adata.write(results_file)

png

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-5wQ4OHqI-1614138422679)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glscmtf5q2j31hb0gj7cw.jpg)]

找差异基因

# 这里使用秩和检验
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='wilcoxon')
sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=25, sharey=False)
adata.write(results_file)

png

num = 2 # 通过这个控制marker基因的数量 
marker_genes = list(set(np.array(pd.DataFrame(adata.uns['rank_genes_groups']['names']).head(num)).reshape(-1)))
len(marker_genes)

# 看一下每一个组的特征基因

adata = sc.read(results_file) 
result = adata.uns['rank_genes_groups']
groups = result['names'].dtype.names
pd.DataFrame(
    {group + '_' + key[:1]: result[key][group]
    for group in groups for key in ['names', 'pvals']}).iloc[0:6,0:6]

# 比较组别间差异
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', groups=['0'], reference='1', method='wilcoxon')
sc.pl.rank_genes_groups(adata, groups=['0'], n_genes=20)
sc.pl.rank_genes_groups_violin(adata, groups='0', n_genes=8)
# 这里需要重载一下结果，如果不重载的话结果会有差异的
adata = sc.read(results_file)
sc.pl.rank_genes_groups_violin(adata, groups='0', n_genes=8)

png

sc.pl.violin(adata, ['CST3', 'NKG7', 'PPBP'], groupby='leiden')

png

new_cluster_names = [
    'CD4 T', 'CD14 Monocytes',
    'B', 'CD8 T',
    'NK', 'FCGR3A Monocytes',
    'Dendritic', 'Megakaryocytes']
adata.rename_categories('leiden', new_cluster_names)
sc.pl.umap(adata, color='leiden', legend_loc='on data', title='', frameon=False, save='.pdf')
sc.pl.dotplot(adata, marker_genes, groupby='leiden');
sc.pl.stacked_violin(adata, marker_genes, groupby='leiden', rotation=90);
adata.raw.to_adata().write('./write/pbmc3k_withoutX.h5ad')

WARNING: saving figure to file figures\umap.pdf

png

至此，标准流程构建完毕，然后试一下上次那篇cell的文章

import scanpy as sc

import os
import math
import itertools
import warnings
import numpy as np
import pandas as pd
import matplotlib.pyplot as plt
%matplotlib inline
%config InlineBackend.figure_format = 'svg'
warnings.filterwarnings("ignore")
plt.rc('font',family='Times New Roman')
my_colors = ["#1EB2A6","#ffc4a3","#e2979c","#F67575"]


sc.settings.verbosity = 3  # 输出提示信息         
# ?sc.settings.verbosity
sc.logging.print_header()
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white')# 设置输出图像格式
results_file = 'write/cell_reproduce.h5ad'  # 存储分析结果
os.chdir('C:/Users/yuansh/OneDrive/课题/unfinishProgram/单细胞和自编码/scell_lung_adenocarcinoma-master/csv_files')
os.listdir()

这里的话介绍一下第二种数据导入的方法，原文中有2套数据，这里的话我就试一下第一套就行，后面的自行尝试

df = pd.read_csv('S01_datafinal.csv',index_col=0).T

cellinfo = pd.DataFrame(df.index,index=df.index,columns=['sample_index'])
geneinfo = pd.DataFrame(df.columns,index=df.columns,columns=['genes_index'])
adata = sc.AnnData(df, obs=cellinfo, var = geneinfo)
adata

接下来的步骤就是把上面的结果copy下来

sc.pl.highest_expr_genes(adata, n_top=20) # 每一个基因在所有细胞中的平均表达量（这里计算了百分比含量）
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=0) # 每一个细胞至少表达200个基因
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=0) # 每一个基因至少在3个细胞中表达 

adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-')
adata.var['mt'].head()

# 抽取带有MT的字符串
adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-') 
# 数据过滤
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], percent_top=None, log1p=False, inplace=True)
# 这套数据是没有线粒体dna的
sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts'],jitter=0.4)
sc.pl.violin(adata, ['total_counts'],jitter=0.4)
sc.pl.violin(adata, ['pct_counts_mt'],jitter=0.4)

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-KsWXv0rX-1614138422685)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glscni9enzj30nc0lnacf.jpg)]

png

#再次强调这套数据没有线粒体dna
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='pct_counts_mt')
sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='n_genes_by_counts')

# 提取线粒体dna在5%以下
adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :]
# 提取基因不超过2500的细胞
adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts < 2500, :]

sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4) # 不要和log顺序搞反了 ，这个是去文库的
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5)
# 可视化
sc.pl.highly_variable_genes(adata)
# 保存一下原始数据
adata.raw = adata

png

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-oUNLNImo-1614138422688)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glsco1yoy3j30uz0guwgo.jpg)]

# 提取高变基因
adata = adata[:, adata.var.highly_variable]
# 过滤掉没用的东西
sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts', 'pct_counts_mt'])
# 中心化
sc.pp.scale(adata, max_value=10)
# pca
sc.tl.pca(adata, svd_solver='arpack')
sc.pl.pca(adata, color='CST3')
sc.pl.pca_variance_ratio(adata, log=True)
adata.write(results_file) # 这里需要关闭一下百度网盘云同步

png

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-XOFuNNkt-1614138422689)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glsco74ippj30gb0hpaao.jpg)]

# 构建图
sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40)
sc.tl.umap(adata)
sc.pl.umap(adata, color=[ 'A4GALT', 'AACS', 'AANAT'])
sc.pl.umap(adata, color=[ 'A4GALT', 'AACS', 'AANAT'], use_raw=False)

sc.tl.tsne(adata)
sc.pl.tsne(adata, color=[ 'A4GALT', 'AACS', 'AANAT'])
sc.pl.tsne(adata, color=[ 'A4GALT', 'AACS', 'AANAT'], use_raw=False)

sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40)
sc.tl.leiden(adata)
sc.pl.umap(adata, color=['leiden',  'AACS', 'AANAT'])
sc.pl.tsne(adata, color=['leiden',  'AACS', 'AANAT'])
# 保存结果
adata.write(results_file)

# 这里使用秩和检验
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='wilcoxon')
sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=25, sharey=False)
adata.write(results_file)

num = 2 # 通过这个控制marker基因的数量 
marker_genes = list(set(np.array(pd.DataFrame(adata.uns['rank_genes_groups']['names']).head(num)).reshape(-1)))
len(marker_genes)

computing neighbors
    using 'X_pca' with n_pcs = 40
    finished: added to `.uns['neighbors']`
    `.obsp['distances']`, distances for each pair of neighbors
    `.obsp['connectivities']`, weighted adjacency matrix (0:00:02)
computing UMAP
    finished: added
    'X_umap', UMAP coordinates (adata.obsm) (0:00:06)

png

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-aNHybOEv-1614138422690)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glscoh4s05j31hq0gjk2t.jpg)]

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-s0GDJaaO-1614138422690)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glscok0km0j31hb0gjan8.jpg)]

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-0Tce4rEo-1614138422691)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glsconiccpj31hq0gjnai.jpg)]

png

# 看一下每一个组的特征基因
adata = sc.read(results_file) 
result = adata.uns['rank_genes_groups']
groups = result['names'].dtype.names
pd.DataFrame(
    {group + '_' + key[:1]: result[key][group]
    for group in groups for key in ['names', 'pvals']}).iloc[0:6,0:6]

# 比较组别间差异
sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', groups=['0'], reference='1', method='wilcoxon')
sc.pl.rank_genes_groups(adata, groups=['0'], n_genes=20)

[外链图片转存失败,源站可能有防盗链机制,建议将图片保存下来直接上传(img-eRqhgnzV-1614138422693)(https://tva1.sinaimg.cn/large/0081Kckwly1glscp2itwnj30h10hjjsc.jpg)]

adata = sc.read(results_file) 
new_cluster_names = ['cluster'+str(i) for i in range(0,38)]
adata.rename_categories('leiden', new_cluster_names)
sc.pl.umap(adata, color='leiden', legend_loc='on data', title='', frameon=False, save='.pdf')
sc.pl.dotplot(adata, marker_genes, groupby='leiden');
sc.pl.stacked_violin(adata, marker_genes, groupby='leiden', rotation=90);

png

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Best Regards,  
Yuan.SH;
School of Basic Medical Sciences,  
Fujian Medical University,  
Fuzhou, Fujian, China.  
please contact with me via the following ways:  
(a) e-mail :yuansh3354@163.com

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