单菌二三代数据组装神器Unicycler-Ragtag连接contig-pyGenomeViz基因组共线分析

Neptuneyut

已于 2024-06-23 13:05:50 修改

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分类专栏： Metagenomics 文章标签：服务器运维 linux

于 2022-10-05 20:24:53 首次发布

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文章目录

简介
2022 更新版本特点
使用简介
安装
快速使用
测试数据集
Unicycler不同组装模式
Ragtag基于参考基因组校正
常见问题

Unicycler github

简介

Unicycler是组装细菌基因组的软件套装。它既可以使用SPAdes组装纯Illumina短读长的二代数据，也可以使用miniasm+Racon管道组装三代长读长数据（PacBio或Nanopore）。进一步，可以同时给它二代和三代数据，它将进行短读长优先的混合组装，以获得最好的组装结果。
软件原理：
Wick RR, Judd LM, Gorrie CL, Holt KE. Unicycler: resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads. PLoS Comput Biol 2017.

如何组装出完整的细菌基因组
Wick RR, Judd LM, Gorrie CL, Holt KE. Completing bacterial genome assemblies with multiplex MinION sequencing. Microb Genom 2017.

2022 更新版本特点

Unicycler最初是在2016年诞生的，当时长读段是稀疏的，而且非常错误率较高。例如，早期的牛津纳米孔测序可能对一个细菌只产生15倍的测序深度，而且大部分的读段有很多错误。因此，Unicycler被设计为优先使用短读段组装出主体，再使用低深度和低精度的长读段来构建短读段组装图，以完成组装，这种方法我称之为短读段优先的混合组装。假设短读组装图处于良好的状态，Unicycler就能很好地做到这一点。

然而，在过去的六年里，情况发生了变化。纳米孔测序的产量现在要高得多，使得>100倍的深度很容易获得，即使是在多个run的项目。读段精度也得到了改善，并且每年都在不断提高。高深度和高精度的长读使得长读段优先混合组装（长读段组装后再进行短读段抛光）成为一种可行的方法，通常比Unicycler更可取。我已经开发了Trycycler和Polypolish，以追求理想的长读段优先组装。

Unicycler并没有完全过时，因为它仍然是细菌基因组短读段优先混合组装的最佳工具。但是我认为它只应该在长读段优先不可行的情况下–即长读深度较低的情况下用于混合组装。我还认为Unicycler适合于短读的细菌基因组，因为它比SPAdes单独产生更干净的组装图。因此，虽然Unicycler最近没有得到我大量的时间和关注，但我还不认为它是废弃软件。
关于一些最新的细菌基因组组装技巧，请查看Trycycler的维基中的这些部分。

我应该用Unicycler还是Trycycler来组装我的细菌基因组？
细菌基因组组装指南

使用简介

作为输入，Unicycler需要以下文件之一：

来自分离细菌的Illumina读段（最好是成对的，但不成对的也可以）。
一组来自细菌的长读段（PacBio或Nanopore）。
来自同一细菌的Illumina读段和长读段（最佳情况）。

使用Unicycler的原因：

它能使复制子（replicons ）成环，而不需要像Circlator那样的单独工具。
它能处理富含质粒的基因组。
它可以在杂交组装中使用任何深度和质量的长读段。完成一个基因组可能需要20倍或更多，但Unicycler可以用少得多的长读段做出几乎完整的基因组。
除了生成可在Bandage中查看的contigs FASTA文件外，它还产生一个组装图。
它能过滤掉低深度的contigs，即使读段集有低水平的污染，也能得到干净的组装。
它的错误组装率很低。
它可以处理高度重复的基因组，如志贺氏菌（Shigella）。
它很容易使用：只需一个命令就可以运行，通常不需要修改参数。

不使用Unicycler的原因：

你正在组装真核生物基因组或元基因组（Unicycler是专门为分离培养的细菌设计的）。
你的Illumina读段和长读段来自不同的菌株（Unicycler在处理样品的异质性时很困难）。
你没有耐心（Unicycler组装结果好，但不是特别快）。

安装

$  mamba create -n unicycler -c bioconda unicycler

快速使用

Illumina-only assembly:

unicycler -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -o output_dir

Long-read-only assembly:

unicycler -l long_reads.fastq.gz -o output_dir

Hybrid assembly:

unicycler -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -l long_reads.fastq.gz -o output_dir

sample_data 目录有示例文件可以用于测试

测试数据集

宋氏志贺菌（Shigella sonnei）plasmids (synthetic reads)

这些是来自宋氏志贺菌53G基因组组装的质粒A、B和E的合成读段。
figshare页面下载reads
志贺菌53G基因组5.22M,GC50.73%，有A、B、C、E共4个质粒
与细菌基因组相比，这些质粒很小，但插入序列会产生许多重复。

最小的质粒可以单独用短读段组装出来
低深度长读段的混合组装能够完成中等大小的质粒组装
而高深度长读段混合组装才能完成所有三个质粒的组装。

# 日志默认标准输出，同时也会在输出结果中产生一个日志
(unicycler)$ time  unicycler -t 50  -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -o only_short_asm &
# real    3m30.019s
(unicycler)$ time  unicycler -t 50  -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -l long_reads_low_depth.fastq.gz -o short_long_low_asm & 
# real    6m42.131s
(unicycler)$ time unicycler -t 50 -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -l long_reads_high_depth.fastq.gz -o short_long_high_asm
# real    8m5.647s

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）

这些是来自幽门螺杆菌样FDAARGOS_300的Illumina和PacBio真实读段。

figshare下载reads

幽门螺旋杆菌的基因组小而简单。它只有两个RNA操作子的拷贝，没有其他大的重复序列，因此与大多数细菌基因组相比，它非常容易组装。

用高深度的长读段进行杂交组装应该能产生一个完整的染色体
用低深度长读段进行的杂交组装非常接近于完成，只剩下几个稍微模糊的点

$ time unicycler -t 100 -l long_reads_high_depth.fastq.gz -o long_asm
# real    1m53.626s

化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）

这些是来自化脓性链球菌样品FDAARGOS_190的真实Illumina和PacBio读段。

figshare下载reads

化脓性链球菌的基因组特别小而且简单，用Illumina读段组装起来相对容易。然而，它有一些重复的元件，包括5个RNA操作子拷贝和六个IS1548的拷贝。

用高深度的长读段进行杂交组装应能产生一个完整的染色体。
使用低深度长读段的混合组装将不太完整，在一些RNA操作子周围留下了一些模糊不清的地方

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）

这些是真实的Illumina和PacBio读段，来自淋病奈瑟菌样品FDAARGOS_204。

figshare下载reads

虽然淋病奈瑟菌的基因组很小，但它是一个很难组装的基因组，有许多IS1016、ISNgo2和其他重复的拷贝。

用高深度的长读段进行杂交组装应该能产生一个完整的染色体
用低深度长读段进行的混合组装，虽然仍比只用Illumina组装有很大的改进，但在一些区域却无法解决
这表明，更复杂的基因组需要更高的长读段深度来实现完整的组装

Unicycler不同组装模式

bold模式有最长的contigs，因此错误比对率也最高，最后得到大于500bp以上的数量最少，conservative模式有最低的错误组装率，因此得到的contig长度最小，数量最多； normal模式在contig长度和组装错误率上有比较好的平衡。

# normal model: moderate contig size and misassembly rate
(unicycler) [yutao@myosin Bacillus_anthracis]$ nohup time unicycler -1 R9-5_1.unpaired.fq.gz -2 R9-5_2.unpaired.fq.gz  -t 50 --min_fasta_length 500 -o R9-5_unicycler_assembly &>R9-5_unicycler_assembly.log&
# bold model:longest contig, more misassambly
(unicycler) [yutao@myosin Bacillus_anthracis]$ nohup time unicycler -1 R9-5_1.unpaired.fq.gz -2 R9-5_2.unpaired.fq.gz  --mode bold -t 50 --min_fasta_length 500 -o R9-5_unicycler_bold_model_assembly &>R9-5_unicycler_bold_model_assembly.log&
# conservative：smaller contigs, lowest misassembly rate
(unicycler) [yutao@myosin Bacillus_anthracis]$ nohup time unicycler -1 R9-5_1.unpaired.fq.gz -2 R9-5_2.unpaired.fq.gz  --mode conservative -t 50 --min_fasta_length 500 -o R9-5_unicycler_conservative_model_assembly &>R9-5_unicycler_conservative_model_assembly.log&

#  --min_fasta_length MIN_FASTA_LENGTH
                                 Exclude contigs from the FASTA file which are shorter than this
                                 length (default: 100)
                                 
#  --mode {conservative,normal,bold}
                                 Bridging mode (default: normal)
                                   conservative = smaller contigs, lowest misassembly rate
                                   normal = moderate contig size and misassembly rate
                                   bold = longest contigs, higher misassembly rate
# 耗时：30min

N50结果
normal和bold模式N50均为189,782比conservative模式169,074大20kb，normal大于500bp的contig数量居中74（基因组居中），bold 68个（基因组最大），conservative80个（基因组最小）；三者最大contig都为570,896

(unicycler) [yutao@myosin Bacillus_anthracis]$ seqkit stats -a R9-5_unicycler_bold_model_assembly/assembly.fasta
file                                                      format  type  num_seqs    sum_len  min_len  avg_len  max_len     Q1        Q2         Q3  sum_gap      N50  Q20(%)  Q30(%)
R9-5_unicycler_bold_model_assembly/assembly.fasta          FASTA   DNA         68  5,253,677      518   77,260  570,896  4,839  35,918.5  101,072.5        0  189,782       0       0
R9-5_unicycler_normal_model_assembly/assembly.fasta        FASTA   DNA         74  5,248,872      518  70,930.7  570,896  4,232  32,799  87,644        0  189,782       0       0
R9-5_unicycler_conservative_model_assembly/assembly.fasta  FASTA   DNA         80  5,244,945      518  65,561.8  570,896  5,632  32,614  79,913        0  169,074       0       0

比对率
基因组最大的bold比对率最高，其次是normal，conservative最低，但是三者相差并不大

# index
 for i in normal conservative  bold ;do bowtie2-build --threads 30 R9-5_unicycler_${i}_model_assembly.fasta R9-5_unicycler_${i}_model_bt2_index  & done            
# mapping
(metawrap)  for i in normal bold conservative;do bowtie2 -x R9-5_unicycler_${i}_model_bt2_index  -1 ../R9-5_1.unpaired.fq.gz -2 ../R9-5_2.unpaired.fq.gz  -p 30 >/dev/null 2>R9-5_unicycler_${i}_model_mapping_rate.txt & done

(metawrap) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ grep -i Overall  *rate.txt
R9-5_unicycler_bold_model_mapping_rate.txt:98.99% overall alignment rate
R9-5_unicycler_conservative_model_mapping_rate.txt:98.82% overall alignment rate
R9-5_unicycler_normal_model_mapping_rate.txt:98.95% overall alignment rate

Ragtag基于参考基因组校正

对于组装后并不成环的contig，需要使用ragtag依据参考基因组将contig排序

# 1.基于参考基因组correct，校正是使用参考基因组来鉴定和校正contigs中的组装错误，该步骤不会将序列减少或增加，仅仅是将序列在错误组装的位置进行打断。
(ragtag) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ time ragtag.py correct B.anthracis_Ames_Ancestor.fna R9-5_unicycler_bold_model_assembly.fasta -t 30 -o Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_correct
# 2.基于上一步校正结果用N连接成scaffold，该步骤是将相邻的contigs序列用100个N连起来，序列的位置和方向需要根据与参考基因组的比对结果确定。
(ragtag) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ time ragtag.py scaffold -t 30 -C B.anthracis_Ames_Ancestor.fna Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_correct/ragtag.correct.fasta -o Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_scaffold

1.结果

# unicycler原始组装结果
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ grep ">" R9-5_unicycler_bold_model_assembly.fasta
>1 length=570896 depth=1.25x
>2 length=362942 depth=0.61x
>3 length=318902 depth=1.00x
>4 length=274270 depth=2.03x
>5 length=272416 depth=2.08x
>6 length=234342 depth=0.71x
>7 length=231813 depth=0.97x
>8 length=209289 depth=0.68x
>9 length=189782 depth=1.64x
>10 length=180292 depth=0.87x
>11 length=169074 depth=1.22x
>12 length=145445 depth=1.50x
>13 length=144041 depth=1.33x
>14 length=143824 depth=0.77x
>15 length=137391 depth=1.77x
>16 length=126712 depth=1.62x
>17 length=105557 depth=2.22x
>18 length=96588 depth=2.15x
>19 length=95132 depth=1.87x
>20 length=91118 depth=0.88x
>21 length=87644 depth=2.27x
>22 length=84120 depth=1.14x
>23 length=73811 depth=0.79x
>24 length=63846 depth=1.75x
>25 length=58175 depth=2.40x
>26 length=57284 depth=1.70x
>27 length=55138 depth=2.97x circular=true
>28 length=53352 depth=1.75x
>29 length=52500 depth=1.50x
>30 length=48204 depth=2.34x
>31 length=45531 depth=2.23x
>32 length=44059 depth=1.48x
>33 length=40830 depth=1.41x
>34 length=37461 depth=1.56x
>35 length=34376 depth=1.40x
>36 length=31222 depth=2.11x
>37 length=29029 depth=0.75x
>38 length=28569 depth=0.87x
>39 length=26552 depth=0.75x
>40 length=23077 depth=0.81x
>41 length=22886 depth=2.23x
>42 length=20525 depth=0.80x
>43 length=18425 depth=1.73x
>44 length=15973 depth=2.21x
>45 length=15625 depth=0.64x
>46 length=15487 depth=2.20x
>47 length=14650 depth=2.25x
>48 length=8224 depth=1.56x
>49 length=7266 depth=1.64x
>50 length=6555 depth=3.79x circular=true
>51 length=5047 depth=2.18x
>52 length=4631 depth=13.67x circular=true
>53 length=2893 depth=1.97x
>54 length=2449 depth=2.08x
>55 length=2443 depth=2.16x
>56 length=1933 depth=0.61x
>57 length=1566 depth=33.30x
>58 length=1498 depth=32.38x
>59 length=1457 depth=2.14x
>60 length=1417 depth=2.11x
>61 length=1371 depth=34.42x
>62 length=1269 depth=5.93x
>63 length=1203 depth=2.06x
>64 length=1039 depth=2.09x
>65 length=1035 depth=2.47x
>66 length=879 depth=8.11x
>67 length=807 depth=14.11x
>68 length=518 depth=18.86x
# ragtag correct结果
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ grep ">" Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_correct/ragtag.correct.fasta
>1
>10
>11
>12
>13
>14
>15
>16
>17
>18
>19
>2_1_353677_+
>2_353678_362942_+
>20
>21_1_9219_+
>21_9220_87644_+
>22
>23_1_40012_+
>23_40013_73811_+
>24
>25
>26
>27_1_34569_+
>27_34570_55138_+
>28
>29
>3
>30
>31
>32
>33
>34
>35
>36
>37
>38
>39
>4
>40
>41
>42
>43
>44
>45
>46
>47
>48
>49
>5
>50
>51
>52
>53
>54
>55
>56
>57
>58
>59
>6
>60
>61
>62
>63
>64
>65
>66
>67
>68
>7
>8
>9

scaffold使用N碱基连接contig

# unicycler原始组装大小
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ bioawk -c fastx '{s+=length($seq)}END{print s}' R9-5_unicycler_bold_model_assembly.fasta
5253677
# ragtag correcr基因组大小：与原始基因组大小一致
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ bioawk -c fastx '{s+=length($seq)}END{print s}' Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_correct/ragtag.correct.fasta
5253677
# ragtag scaffold基因组大小
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ bioawk -c fastx '{s+=length($seq)}END{print s}' Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_scaffold/ragtag.scaffold.fasta
5260577
# scaffold包含的N碱基数量
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ grep -o "N" Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_scaffold/ragtag.scaffold.fasta|wc -l
6900
(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ echo |awk '{print 5260577-5253677}'
6900

校正之后基因组已经按照参考基因组序列重排
在https://proksee.ca/右侧Tools的fastANI中可视化，但是只支持2个基因组
2.圈图结果
在https://proksee.ca/可视化细菌基因组圈图
下图为未成环的基因组，最大特点是基因组GC Skew交错并不连续，而经过ragtag校正并且连接成scaffold的有明显的GC skew正负分界。
2.基因组共线分析（collinear）
在pyGenomeViz（https://pygenomeviz.streamlit.app/）上传多个基因组的gbk文件进行共线分析（注意是按照上传顺序展示的，上传后不可调整），左侧Plot link method使用MUMmer (nucleotide)。
prokka生成gbk文件

(prokka) [yutao@myosin R9-5_unicycler_assembly]$ prokka --cpus 50  --prefix R9-5_unicycler_bold_model_ragtag_correct_prokka  Ragtag_correct/R9-5_unicycler_bold_model_correct/ragtag.correct.fasta

在这里插入图片描述

常见问题

RecursionError: maximum recursion depth exceeded

可能原因：原始数据存在多个物种污染

Read depth filter: removed 5215 contigs totalling 2053037 bp
Deleting /datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/MD-228/spades_assembly/


ESC[93mESC[1mESC[4mDetermining graph multiplicityESC[0m (2024-01-25 02:14:52)
    Multiplicity is the number of times a sequence occurs in the underlying
sequence. Single-copy contigs (those with a multiplicity of one, occurring only
once in the underlying sequence) are particularly useful.
RecursionError: maximum recursion depth exceeded
...
RecursionError: maximum recursion depth exceeded

解决方法：直接使用spades组装：

(unicycler) [yut@node02 Scripts]$ nohup time spades.py -1 /datanode02/yut/04_MicroFungi/Trimgalore/Clean_reads/MD-228_1.fq.gz -2 /datanode02/yut/04_MicroFungi/Trimgalore/Clean_reads/MD-228_2.fq.gz -o /datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/MD-228_spades --isolate  -t 30  &>/datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/MD-228_spades.log &

Error: miniasm assembly failed

除了软件安装不完整外，另外一种可能是测序深度太低。你有多少bp的长读段，你的基因组有多大？Miniasm对低深度的长读段无法组装。如果这是一个混合组装，那么miniasm组装失败也不一定是个问题–Unicycler可以用其他方法为Illumina组装图提供支架。
然而，如果你的长读段是相当高的深度（20倍或更多），而它仍然失败，那么就不太确定了，我们必须深入挖掘。

Unable to polish assembly using Pilon: Pilon encountered an error

Pilon version 1.24 Thu Jan 28 13:00:45 2021 -0500
Genome: 1_polish_input.fasta
Exception in thread "main" java.lang.OutOfMemoryError: Java heap space
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeRegion.<init>(GenomeRegion.scala:57)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$contigRegions$1(GenomeFile.scala:73)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$contigRegions$1$adapted(GenomeFile.scala:73)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile$$Lambda$31/0x0000000100149040.apply(Unknown Source)
        at scala.collection.immutable.Range.map(Range.scala:59)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.contigRegions(GenomeFile.scala:73)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$regions$1(GenomeFile.scala:53)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile$$Lambda$30/0x0000000100148040.apply(Unknown Source)
        at scala.collection.immutable.List.map(List.scala:250)
        at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.<init>(GenomeFile.scala:53)
        at org.broadinstitute.pilon.Pilon$.main(Pilon.scala:108)
        at org.broadinstitute.pilon.Pilon.main(Pilon.scala)

解决方法：
找到pilon脚本的位置，打开源码修改如下代码，即将pilon使用的java默认最小及最大内存设置更大数值
$ vi ~/Software/Miniconda3/envs/unicycler/bin/pilon

default_jvm_mem_opts = ['-Xms100g', '-Xmx999g']
#default_jvm_mem_opts = ['-Xms512m', '-Xmx1g']

下载unicycler github测试数据，运行如下命令测试是否成功

time unicycler -1 short_reads_1.fastq.gz -2 short_reads_2.fastq.gz -l long_reads_low_depth.fastq.gz --verbosity 3 -t 20 -o short_long_assembly &>log&

Failed to determine offset! Specify it manually and restart, please!

== Running read error correction tool: /datanode02/yut/Software/Miniconda3/envs/unicycler/share/spades-3.13.1-0/bin/spades-hammer /datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/Tricholomamatsutake_Z951-R01/spades_assembly/read_correction/corrected/configs/config.info

  0:00:00.001     4M / 4M    INFO    General                 (main.cpp                  :  75)   Starting BayesHammer, built from refs/heads/spades_3.13.1, git revision 9a9d54db2ff9abaac718155bf74c12ec9464e8ca
  0:00:00.026     4M / 4M    INFO    General                 (main.cpp                  :  76)   Loading config from /datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/Tricholomamatsutake_Z951-R01/spades_assembly/read_correction/corrected/configs/config.info
  0:00:00.049     4M / 4M    INFO    General                 (main.cpp                  :  78)   Maximum # of threads to use (adjusted due to OMP capabilities): 10
  0:00:00.050     4M / 4M    INFO    General                 (memory_limit.cpp          :  49)   Memory limit set to 250 Gb
  0:00:00.051     4M / 4M    INFO    General                 (main.cpp                  :  86)   Trying to determine PHRED offset
  0:00:01.839     4M / 4M    ERROR   General                 (main.cpp                  :  89)   Failed to determine offset! Specify it manually and restart, please!


== Error ==  system call for: "['/datanode02/yut/Software/Miniconda3/envs/unicycler/share/spades-3.13.1-0/bin/spades-hammer', '/datanode02/yut/04_MicroFungi/Unicycler_assembly/Tricholomamatsutake_Z951-R01/spades_assembly/read_correction/corrected/configs/config.info']" finished abnormally, err code: 255

解决：https://github.com/rrwick/Unicycler/issues/279

$ mamba update bioconda::unicycler
(unicycler) [yut@node03 04_MicroFungi]$ unicycler --version
Unicycler v0.5.0
# 现在Illumina数据都是phred33，因此添加--spades_options "--phred-offset 33"选项运行

Error: SPAdes failed to produce an assembly graph

原因：之前kmer组装结果不完整，后续无法迭代
解决：删除输出目录，重新运行

Neptuneyut

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单菌二三代数据组装神器Unicycler-Ragtag连接contig-pyGenomeViz基因组共线分析

Unicycler是组装细菌基因组的软件套装。它既可以使用SPAdes组装纯Illumina短读长的二代数据，也可以使用miniasm+Racon管道组装三代长读长数据（PacBio或Nanopore）。进一步，可以同时给它二代和三代数据，它将进行短读长优先的混合组装，以获得最好的组装结果。如何组装出完整的细菌基因组来自分离细菌的Illumina读段（最好是成对的，但不成对的也可以）。一组来自细菌的长读段（PacBio或Nanopore）。来自同一细菌的Illumina读段和长读段（最佳情况）
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