单细胞文献阅读（1）

文章基本信息

标题
Comprehensive single-cell sequencing reveals the stromal dynamics and tumor-specific characteristics in the microenvironment of nasopharyngeal carcinoma
作者
这个作者是港大的

主要内容

这篇文章主要做了14个样本，这14个样本中大部分都是得了鼻咽癌的病人，有3个是对照（鼻咽部淋巴增生）。作者对这些样本进行了单细胞测序。主要是采用5‘端测序，然后还有VDJ，测了B细胞和T细胞。
这篇文章主要的套路是，首先对所有的细胞（包括鼻咽癌患者和正常人的细胞）进行注释，然后比较处理组和对照组中每一个cluster的数量变化。然后查看每一个病人中这些细胞类型的相对含量。
接着作者分别对T细胞，B细胞，骨髓细胞这三种类型进行进一步的注释和细分。其中对T细胞分析的最透彻。

T细胞分析
作者将所有样本的T细胞都收集起来，然后进行了细分。然后查看了对照组和处理组中这些cluster的数量的变化。并且使用bulk RNA-seq数据集进行了验证(这里能用bulk的数据进行验证单细胞水平是因为它采用了去卷积的方法）。然后分别对对照组-drived的和处理组-drived的T细胞进行了GSEA hallmark pathway富集。这个GSEA hallmark pathway 应该是作者首先在上一步挑出了对照组和实验组分别显著表达的基因，然后做了GSEA功能富集分析？？。

接着作者使用MAST analysis找到了两组中的差异基因, 作者对这些**差异基因做了调控分析，主要寻找哪些TF能够分别调节这些上调的基因和下调的基因，**主要是寻找哪些转录因子调节这些差异基因。作者接着找了一个在NPC中高表达的基因，然后将病人分成对这个基因高表达的组和低表达组，然后发现在高表达的病人组里，另外一个细胞的类型含量高（根据文献报道该细胞类型与这个基因有关系）。接着将这两组表达的病人与存活率联系在一起。注意这个预后是别的bulk数据。这14个病人没有存活率的数据。

这个对我的启示：我在后面也想把promoter usage和survival联系在一起。也就是想证明promoter usage和存活率之间的关系比expression 和存活率之间的关系更为紧密，那么我也需要存活率的数据，这个数据可以来自于bulk RNA-seq。

作者把T细胞的功能主要分成了四类（naive 细胞毒杀 exhaustrion Treg)。然后从这四类功能中分别挑出了代表性的4个基因，然后找到一些与这4个基因相关性比较高的基因。使用这些基因在不同T细胞中的表达weight,建立了线性模型，这个线性模型会给每一个基因都分配一个参数，然后利用这个线性模型计算了不同细胞中的各种分数 （cytotoxic score, exhaustion score, naive score 和Treg score)。 接着作者为了确定它们的线形模型的可靠性，他做了功能分数和相应的细胞等abundance的相关性分析（这个相关性分析既在discovery cohort中做，又在validation cohort中做）。除此之外还和bulk中的相关基因的表达做相关性。

这个对我的启示：我现在有不同的cell type，这些cell type之间，有的是非常相似的。那么我是否可以挑选几个代表性的基因，然后与找到这些代表性的基因的correlation非常高的基因，然后建立一个线性模型，然后求不同细胞类型中的相关性分数。所以对细胞类型进行细分，我觉得可以增加我们的说服力。

接着作者引入了VDJ测定得到的结果，对于TCR得到的结果中，分成了两组，一组是病人的ID，另外一组是实验和对照组，比较这两个level中的clone的size。并且将clone size和不同的分数做相关性分析。

使用monocle做CD8 T细胞和CD4 T细胞中的细胞运行轨迹。

接着对B细胞和骨髓瘤细胞做了同样的分析。

接着是和生存分析的联系。 作者通过单细胞的分析总共找到了不同的subpopulation中的代表性基因的gene matrix。然后作者使用这个gene matrix，以及bulk RNA-seq 的表达数据，使用CIBERSORTx去卷积来估计免疫abundance.基于这个immune abundace, 作者将88个病人分成了active的和nonactive的病人，然后计算每一个病人的四个分数。然后作者进行对不同的细胞亚类和不同进程的病人评估了hazard ratio。找到了与存活率有关的因素。
这一部分需要结合上面生存分析的继续研读。

接着作者做了细胞间通讯，主要使用软件cellphoneDB.