前言
1.1、（显微镜）发展历史
1.2、（显微镜）光学元件
物镜 —— 由若干个透镜组成的一个复合透镜
- 主要功能：放大图像
- 其他功能：提高分辨率、改变焦距和聚焦、收集光信号
一、（相机）分辨率的影响因素：像元尺寸 + 信噪比
（相机）分辨率由像元尺寸和信噪比相互制约。
- （1）若相机的像元尺寸越小，则单位距离内的像素越多，分辨率越高。
- （2）若相机的像元尺寸越大，则落到一个像素上的光子就越多，信噪比越高。
1.1、（相机）分辨率的数学概念
若相机的像元尺寸不变，则像素越多，分辨率越高。
像素：是数字图像的最小单元。分辨率：在每个方向上的像素个数。
1.1.1、显示屏分辨率
每英寸像素（Pixels Per Inch, PPI）, 又称为屏幕像素密度。即每英寸上的像素个数。
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显示屏尺寸：显示器屏幕对角线的长度，单位英寸（1英寸 = 25.4毫米）
举例：
已知：主屏尺寸 = 4英寸，主屏分辨率 = 800 x 480像素
计算： 勾股定理 = (800 * y)^2 * (480 * y)^2 = 4^2 => y = 4.287464628
长宽尺寸 = (800 x 480) * y = 3.430 x 2.058英寸（87.1 x 52.3毫米）
（长）每英寸上有800/3.430=233个像素，每个像素尺寸87.1/800=0.109毫米
结论：显示屏由800x480=384000个像素组成，每个像素尺寸为0.109毫米。
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（1）若图像大于显示屏，则需要滑动滚动条才能看完全图。
（2）若图像小于显示屏，则会居中显示，且无图显示处为黑框显示。
1.1.2、相机分辨率
人类毛发直径： 范围介乎0.017至0.18毫米之间。
人眼极限范围： 人的眼睛最小能看到0.02-0.01毫米粗细的小点，即PPI = 1270 x 2540
人眼视野范围： 单个眼睛，左右视野范围=160、上下视野范围=120
视角范围 = 160:120 = 4:3
因此，大部分相机的成像尺寸以此居多。还有5:4、16:10
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相机分辨率（4:3） 15万像素 = 480 x 320 = 153600
20万像素 = 640 x 320 = 204800
30万像素 = 640 x 480 = 307200
50万像素 = 800 x 600 = 480000
80万像素 = 1024 x 768 = 786432
100万像素 = 1140 x 900 = 1026000
130万像素 = 1280 x 960 = 1228800
200万像素 = 1600 x 1200 = 1920000
300万像素 = 2048 x 1536 = 3145728
500万像素 = 2560 x 1920 = 4915200
800万像素 = 3264 x 2448 = 7990272
1000万像素 = 3648 x 2736 = 9980928
1200万像素 = 4000 x 3000 = 12000000
1400万像素 = 4228 x 3264 = 13800192
1.2、像元尺寸 —— 单个像素的物理尺寸（即：像素分辨率）
像元（Pixel）：图像的最小单元，它代表了图像中的一个点（在图像中，又叫像素），具有一定的大小和灰度值。像元尺寸：每个像元在物理空间中的大小。
- 单位：用长度单位来表示（如：毫米、微米、纳米），取决于图像采集时所用的设备以及成像物体的尺寸。
- 作用：像元尺寸的大小对图像的分辨率和细节捕捉能力有着重要的影响。通常情况下，更小的像元尺寸能够提供更高的空间分辨率，因为它们能够更精细地捕捉到图像中的细节。
（相机）像素分辨率：单个像素的物理尺寸（像元尺寸）（相机）图像分辨率：单位距离内的" 像 "，需要多少个像素点来显示- 已知：相机的像元尺寸 = 6.5μm、物镜的放大倍率 = 40；即 1 μm 的 " 物 " 经光学系统放大后得到 40 μm 的 " 像 "。
- 可得：
- （1）
像素分辨率 = 像元尺寸 / 放大倍数 = 6.5(μm) / 40 = 0.162(μm / pixel)—— 单个 pixel 的物理尺寸为 0.162 μm- （2）
图像分辨率 = 放大倍数 / 像元尺寸 = 40 / 6.5(μm) = 6.15(pixel / μm)—— 单位 μm 距离内有 6.15 个pixel
1.3、信噪比
二、（显微镜）分辨率的影响因素：相机分辨率 + 光学分辨率
滨松相机：像元尺寸和光学分辨率的关系
在显微成像系统中，使用分辨率来评价其成像能力的好坏。
- （1）光学分辨率高 + 相机分辨率低，则实际分辨率会降低到图像分辨率以下；
- （2）光学分辨率低 + 相机分辨率高，则同样也看不清物体的精细结构。
2.1、（显微镜）分辨率的数学概念
2.1.1、数值孔径 —— 显微镜中物镜的重要参数
数值孔径（Numerical Aperture，NA）：反映了物镜对进入显微镜的光线的采集能力和成像能力。
- 倒置成像：由于物镜对光线的折射性质，当物镜将光线聚焦到焦平面时，图像是倒置的。
焦平面 - 介绍：是距离物镜为一个焦距的平面。在焦平面上形成了一个倒置的、被物镜放大的图像。焦平面 - 功能：在焦平面上形成的图像会达到最佳的清晰度和焦距效果。
物镜的数值孔径NA越高，分辨率越好（与放大倍率无关）。
| 放大倍率（NA） | 显微镜的分辨率极限 |
|---|---|
| 4x(0.20) | 1.5 |
| 10x(0.45) | 0.64 |
| 20x(0.75) | 0.39 |
| 40x(0.85) | 0.34 |
| 40x(1.30) | 0.22 |
| 60x(0.95) | 0.31 |
| 60x(1.40) | 0.21 |
| 100x(0.90) | 0.32 |
| 100x(1.25) | 0.23 |
| 100x(1.40) | 0.21 |
2.1.2、艾里斑
艾里斑（Airy disk）：光通过物镜，由于光学衍射效应，呈现出中心明亮、周围环绕暗环的光斑。
- 是光学显微镜中，点光源的成像结果（也是PSF的一种形式）
- 特征1：中央的亮斑被称为
艾里斑核（Airy disk core）- 特征2：周围的同心环被称为
艾里环（Airy rings）- 特征3：中心点包含大约84％的发光强度，其余16％围绕该点分布在衍射图样中。
2.1.3、阿贝的衍射极限 —— 解释了显微镜的衍射极限（艾里斑）
- 理论：图像是由（多个重叠的，多强度的）衍射极限点（或艾里斑）组成。
- 公式：
- 阿贝衍射极限（横向，即XY分辨率）：
d = λ / （2 * NA）- 阿贝衍射极限（轴向，即Z分辨率）：
d = 2 * λ / （NA^2）
- λ 为光的波长
- NA 为物镜的数值孔径
2.1.4、瑞利判据 —— 定义了衍射极限系统中的分辨率极限
- 理论：当两个艾里斑不断接近，直到肉眼不可分辨时，两个艾里斑的中心距离就是此物镜的分辨率（极限）。
- 公式：
NA = （1.22 * λ）/ （2 * NA） = （0.61 * λ）/ NA
以下为两个艾里斑的重叠衍射图，其显示了分辨率极限（由瑞利准则定义）
左：分辨率良好—— 两个单独的艾里斑不重叠中：分辨率极限—— 当一个艾里斑中心与另一个衍射图的第一个最小值直接重叠右：不具有分辨率—— 若艾里斑比中间的更近，不满足瑞利准则。
2.1.5、奈奎斯特采样定律 —— （理论上）最大采样步长 = 像元尺寸的一半
- 已知：显微镜的分辨率极限（样品端） = 0.22μm，物镜的放大倍率 = 100x
- 计算：放大后的分辨率极限（相机端） = 22μm
奈奎斯特采样定律（Nyquist）：
（1）采样频率：若对一个连续信号进行采样并完全恢复出原始信号，则采样频率应该大于等于模拟信号频谱中最高频率的两倍
（2）采样周期：为了准确地重建信号，采样周期必须大于等于信号周期的两倍。
（3）采样步长：为了准确地重建信号，采样步长必须小于等于像元尺寸的一半。
- 采样周期：采样点之间的时间间隔，是采样步长的倒数。
根据奈奎斯特采样定律：
（1）当像元尺寸大于22μm的一半（11μm），相机无法分辨出间距在22μm以上的两个物体；
（2）当像元尺寸等于22μm的一半（11μm），可分辨。
（3）当像元尺寸小于22μm的一半（11μm），可分辨。
注意：像元尺寸并非越小越好
（相机）分辨率由像元尺寸和信噪比相互制约。
- （1）若相机的像元尺寸越小，则单位距离内的像素越多，分辨率越高。
- （2）若相机的像元尺寸越大，则落到一个像素上的光子就越多，信噪比越高。
2.2、光学分辨率 —— 两个像素的物理间距（即：两个艾里斑的中心距离）
-
系统的光学分辨率：指 " 物 " 在经过光学系统后的 " 像 "在细节上能被分辨的最小距离。 （极限的）光学分辨率：即：最小距离 = 瑞利判据的分辨率极限。
左（像素点） —— 中（艾里斑） —— 右（黑白条纹）
（左）光学分辨率：使用光学系统所能分辨的两个像素点的最小距离（瑞利判据）来表示。
- 第一行：
大于最小距离的两个像素点（左），两个艾里斑不重叠（中），经过光系统后会被识别为两个点（两个独立点）；- 第二行：
等于最小距离的两个像素点（左），两个艾里斑重叠且距离达到瑞利判据的极限，经过光系统后仍会被识别为两个点（两个耦合点）；- 第三行：
小于最小距离的两个像素点（左），两个艾里斑重叠且距离大于瑞利判据的极限（中），经过光系统后会被识别为一个点。（右）黑白条纹：间隔越宽的黑白条纹越容易分辨（类比艾里斑的重叠）。
2.2.1、光学系统 —— 低通滤波器（通低频阻高频）
-
光学系统：可以看作是一个空间上的低通滤波器（通低频阻高频），故从 " 物 " 到 " 像 " 的过程中会发生 " 失真 " 。
通俗理解：削弱了由" 黑 “到” 白 "的锐度和对比度，使其变得平滑和模糊。
（左）原始条纹A：使用黑白表示灰度值（0 / 255），并构成一个方波信号。（右上）图像B：经过系统1，条纹密度变高（宽）。使得展宽的峰互相交叠，导致重叠部分的对比度下降（20%）。（右下）图像B'：经过系统2，条纹密度变低（细）。保留了更多的高频信号，使得信号的变化斜率更大，对比度更接近真实（90%）。
2.2.2、（极限的）光学分辨率 —— 瑞利判据的分辨率极限
- 光学上的极限分辨率（理论值）
= 瑞利判据公式 = 0.61 * λ / NA- λ为波长（对于荧光显微镜，就是荧光探针的发射波长）；
- NA为物镜的数值孔径（可以在物镜上找到）；
连续信号的离散采样：相机芯片在x方向上以像元尺寸为单位距离，均匀对曲线作积分，得到每个像素值。
相机芯片上的像素以固定距离排列，而采样频率越高，则空间周期(d)越短。
采样周期(I)：表示像元尺寸采样频率：表示单位距离内像素点的个数（即：白色/黑色条纹重复出现的频率）空间周期(d)：表示光学分辨率（如：条纹间距、像素间距）
- （光学分辨率 × 放大倍率）：表示 " 物 " 点在经过物镜放大后的 " 像 " 点的距离。
- 像元尺寸(I) = 放大倍率 * 光学分辨率 / 2
2.2.3、（实际的）光学分辨率 —— 木桶 - 短板效应
-
木桶 - 短板效应：在整个成像系统分辨率上（木桶），光学分辨率和图像分辨率就好比木桶上的两块木板，最终成像系统的分辨率等于短板的那一个。
举例：一台荧光显微镜，采用NA = 1.4的63倍油浸镜，光路中没有其他放大；观察λ = 509nm的荧光样本。
- 相机类型1：像元尺寸 = 6.5 um
- 光学分辨率 = 0.61 * 509 nm / 1.4 = 222 nm（不变）
- 图像分辨率 = 2 * 6.5 um / 63 =
206 nm
- 结论：由于光学分辨率差（数值越大，分辨率越低），故整个系统的分辨率是受限于光学分辨率（ = 222 nm）。
- 相机类型2：像元尺寸 = 11 um
- 光学分辨率 = 0.61 * 509 nm / 1.4 = 222 nm（不变）
- 图像分辨率 = 2 * 11 um / 63 =
349 nm
- 结论：由于图像分辨率差（数值越大，分辨率越低），故整个系统的分辨率是受限于图像分辨率（ = 349 nm）。
（实际的）像元尺寸应该小于（理想的）像元尺寸，像元尺寸越小对细节的解析越好，但小于理想值的1/2就无显著性改善了。
（相机）分辨率由像元尺寸和信噪比相互制约。
- （1）若相机的像元尺寸越小，则单位距离内的像素越多，分辨率越高。
- （2）若相机的像元尺寸越大，则落到一个像素上的光子就越多，信噪比越高。
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