illumina SBS测序详解

最近回头重新看了illlumina paired end sequence的测序原理视频，发现了以前没有注意的一些问题，而这些问题也是大家平时容易搞错的，因此花了几天时间将illumina 的paired end sequence 从构建文库到上机测序的整个过程以及原理较为详细的写了出来。

基础知识：illumina测序的核心在于利用可逆终止的、荧光标记的dNTP进行边合成边测序

                  Flowcell（流动池）是有着2个或8个lane（泳道）的玻璃板，。每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一  致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。一个lane包含两列，每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。

paried-end sequencing

一、Library Preparation文库的构建

  1. 利用转座子（transposome）对双链DNA进行剪切以及接头（adapter）的连接

  2. 接头连接成功后，利用低循环扩增技术在接头处进行修饰，分别在两端添加sequencing primer binding site1/sequencing primer binding site2（即测序引物结合位点）、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列

上图并没有将之前的adapter标志出来，下图是维基百科的示意图，详细一些。

这里要注意两点（1）P5和P7是不同的，它们分别和flowcell上的接头互补和相同。为了方便阐述，将与P5互补的接头称为P5’，与P7互补的接头称为P7’。（2）index1和index2也是不同的，与P5相连的是index2，与P7相连的是index1。

     关于index，也叫barcodes，因为一个lane可以同时测多个样品，为了避免混淆样品的read products，每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序得到的reads都是具有index标记的，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据。而这里的 index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads。

二、Cluster generation 簇生成

  1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列&#