测序技术回顾与第三代测序技术展望

摘要 ： DNA 测序技术是分子生物学实验中的重要的实验手段。 几十年来， 测序技术发展飞快， 本文简述了测序技术的发展历程， 详述了以单分子测序和基因组光学图谱技术为代表的第三代测序技术。
关键词： DNA 测序技术； 单分子测序； 基因组光学图谱技术
The sequencing technology review and the third-generationsequencing future perspective
Abstract：

DNA sequencing technology is one of most important experiment  methods in molecular biology field. For several decades, sequencing technology has been developing quickly. In the paper, it briefly introduces the development process of sequencing technology, and recommends the single molecule sequencing technology and Optical mapping solutions in detail, which are the representatives of the third generation sequencing technology.
Key words： DNA sequencing; Single-molecule sequencing; Optical mapping solutions
          1953 年 Watson 和 Crick 揭示了 DNA 的双螺旋结构 [1] ， 这大大激励了人们对 DNA 序列的探索。于是 DNA 测序技术应运而生， 是现代分子生物学中重要的实验手段。 DNA 测序技术及伴随产生的基因操纵技术它极大地推动了生命科学的发展 [2][3] 。现介绍 DNA 测序技术的发展历史及第三代测序技术中两个代表性的技术单分子测序和基因组光学图谱技术。
一、 DNA 测序技术的发展历史
DNA 测序技术迄今经历了三代的发展。 DNA 测序技术成熟于上世纪 70 年代中后期， 随后的 20 多年第一代测序技术测出了不少简单的小型基因组。 1990年提出人类基因组计划（Human Genome Project ,HGP）， 逐步诞生了高通量第二代测序技术。 近年来， 单分子等第三代测序技术开始出现， 也预示着测序技术将应用更广， 测序的成本越低 [4][5] 。
1.1 第一代测序技术
1975 年 Sanger 和 Coulson 发明了“Plus and Minus” （俗称“加减法”）测定 DNA序列 [6] ； 1977 年 Maxam and Gilbert 发明了化学降解法测序 [7] ； 1977 年 Sanger 引入 ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）， 发明了著名的双脱氧链终止法 [8] 。 双脱氧链终止法有效控制了化学降解法中化学毒素和同位素的危害， 在随后的二十多年得到很好的应用。 这些技术及在此基础上发展的相关技术统称为第一代测序技术。
（Stephan C Schuster Next-generation sequencing transforms today’s biology） 第一代测序技术在人类基因组计划中有了极大作用与发展[9] 。
1.2 第二代测序技术
随着人类基因组计划的完成， 人们开始进入后基因组时代（post-genomicera）。 科学家逐步测出多种生物的序列， 传统的测序技术已经无法满足高通量和高效率的大规模基因组测序， 第二代DNA测序技术（next-generation sequencing）就诞生了[10] 。 第二代测序技术主要有Roche公司应用焦磷酸测序原理的454测序技术及454基础上的GS FLX、 GS Junior测序平台 [11] ； Illumina公司应用合成测序原理的新一代Solexa Genome Analyzer测序平台， ABI公司使用连接技术的Solid测序平台。 第二代测序技术实现了高通量、 高效率、 高准确度的测序大大降低了测序的成本， DNA测序可以向个人测序发展。 第二代测序技术很好应用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism， SNP） 的研究， 对探索人类的遗传及基因病有极大的意义 [9] 。
1.3 第三代测序技术
然而在遗传学中， 成千上万的基因组需要测出及分析， 高通量的二代技术还是面临成本高、 效率低、 准确度不是很高等的难题， 第三代测序技术已经开始崭露头角。 第三代测序技术主要有Helicos公司开发的单分子测序、 CompleteGenomics公司对人类大型基因组研究中最新技术 [12] 、 OpGen公司的OpticalMapping Solutions测序等。
二、 单分子测序(Single-molecule sequencing)
单分子测序1989年被J. H. Jett等提出来的 [13] 。 单分子测序在近些年来发展迅速， Timothy D. H.等使用了单分子测序的测序方法测定了M13病毒的基因组 [14] ，Doron Lipson等使用单分子测序的方法研究了Saccharomyces cerevisiae DBY746的转录组 [15] 。 Helicos公司开发了新型的单分子测序仪 [16] 。
2.1.单分子测序原理
Helicos 公司单分子测序仪的技术原理是利用合成测序理论， 将样本 DNA 数以百万的单链分子绑定在该仪器特有的、 没有背景荧光的玻璃表面， 通过加入荧光标记的核苷酸(一次加入 4 种核苷的 1 种)和聚合酶到单分子阵列中， 核苷酸会结合到 DNA 分子上特异性结合的位点上。 用激光激发结合在 DNA 分子上的荧光标记的核苷酸， 使标记物发出荧光， 相机以 15ms 速度快速扫描整个阵列， 检测特异性结合到 DNA 片断上的荧光碱基。 在此之后， 结合的核苷酸对会被移动除去， 然后， 通过重复加入标记的核苷酸来重复这一过程 [16] 。

 

2.2 单分子测序步骤
2.2.1 单程单分子测序（single-pass sequencing） （见图 1）
1 将 DNA 双链解开成单链， 在 3’端加上标记的多聚 A 尾(poly A tail)， 再用末端转移酶封闭 3’端。
2 3’端与固定在仪器表面的基因组模板寡核苷酸的 5’端以共价键的形式杂交。
3 通过所提取的基因组模板合成测序的位点。
4 在测序仪器玻璃表面加入被标记的碱基和 DNA 聚合酶的混合液， 碱基自然延长， 使用 647nm 的荧光下对 Cy5 直接扫描成像。
5 使用化学方法对去除碱基中的染料标记。
6 加 入 新 的 标 记 的 碱 基 和 DNA 聚 合 酶 使 反 应 继 续 循 环 下 去 。

图 1： 单程单分子测序

                                  图 2： 双程单分子测序
2.2.2 双程单分子测序（two-pass sequencing） （见图 2）
在单程单分子测序中， DNA 样品是与仪器玻璃表面的固定的寡核苷酸相杂交。 DNA 复制的时候， 其共价连接的模板也同时复制， 在模板的末端提供引物序列。 这个引物序列用于合成法测序。 一个测序反应后， 合成链解开， 一个新的引物杂交上去， 进行第二次测序。
2.3 单分子测序的优势
单分子测序减少了试剂的使用， 测序成本价格大大降低， 使得人的基因组测序低于 1000 美元慢慢走向可能。 此处 Helicos 公司还有一个优势， 就是它不需要扩增建立 DNA 库， 从而切断数据结果中潜在错误的来源。
三、 基因组光学图谱系统(Optical Mapping Solutions)
Phil Latreille 等利用光学图谱研究了 X. nematophila 基因组， 完成了基因组的组装 [17] 。 OpGen 公司在近年开发了一种新型的光学图谱技术 [18] 。
3.1 光学图谱技术原理 [18]
这种光学图谱技术是一个利用单个 DNA 分子基因组限制性内切酶图谱快速生成高分辨率、 有序的全基因组限制性内切酶图谱的方法。 该技术提供了一种从纯菌株或混合样品中全面了解细菌、 酵母或真菌的基因组结构的方法。 这一技术方法的优势在于能够提供有序、 高分辨率的多于 100 个限制性内切酶酶切位点/数 MB 的图谱， 而不需要进行耗时和耗力的基因组测序。
3.2 光学图谱技术的实验步骤 [18]
1 提取 DNA
从微生物细胞中提取高分子量的 DNA(High molecular weight ,HMW DNA)。将微生物细胞包埋在低熔点的琼脂糖中， 用裂解液进行处理。 再将裂解液完全洗净， 在 70℃下溶解琼脂糖， 使用 β-琼脂糖酶释放出 HMW DNA。 样品的预处理随微生物样品不同而异。
2 DNA 固定与消化
基因组 DNA 以单分子的形式固定在带电的光学基质上， 再使用限制性内切酶进行消化。将制备 HMW DNA载入微流体光学芯片的阵列孔道中。基因组 DNA以单个 DNA 分子的形式固定在长的平行的阵列中， 固定的 DNA 依然保持其原有的静电属性。 DNA 被限制性内切酶处理， 切得的限制性酶片段按 DNA 原来的顺序保持不变。
3.染色与组装
将基因组 DNA 进行染色、 扫描、 计算、 组装一系列工作， 作出全基因组限制性内切酶酶切图谱。
消化的 DNA 使用荧光染料染色， 再置于全自动的荧光显微观察仪采集数据。OpGen公司配套的图像分析软件测量每个 DNA分子限制性内切酶片段的大小和顺序， 光信号转化成数字信号生成单个 DNA 分子的限制性内切酶酶切位点图谱。通过 DNA 分子限制性内切酶酶切位点图谱相互重叠的部分拼接得到全基因组限制性内切酶酶切位点图谱——光学图谱。
4. 分析
应用 OpGen 的“MapSolver”光学图谱软件， 可以比较不同的基因组的遗传变异， 完成高分辨率的流行病学分析和加快基因组测序工作的完成。
3.3 光学图谱技术的优点及应用
该技术拥有很大的优点： 1.不用扩增 ； 2.无需 PCR 反应； 3.不需基因组抽提的试剂； 4.不需末端配对的文库； 5.不用具有序列信息； 6.强大的分析软件基因组光学图谱技术在比较基因组学、 流行病学、 食品安全、 菌种质量监控、全基因组序列拼接、 菌株分型等有重要应用。
展望
随着 HGP 的实施与完成， DNA 测序技术得到了飞跃的发展， 在科技迅速发达的当今社会， 新的测序技术提出的周期也越来越短。 越来越多的生物全基因组的成功测序， 也极大的推动了遗传学、 免疫学、 肿瘤学等的理论研究， 也促进了基因组信息在临床医学中应用。

测序技术发展的趋势就是不断发展， 创造更为科学、 廉价、 更高效率的测序技术， 使得其更好应用在临床应用中。 但是随着个人
基因图谱时代的来临， 同样测序技术也面对很多挑战， 比如隐私问题， 基因图谱是个人的隐私， 如何保证在治疗过程中被泄露或是被他人改变基因图带来很多的负面问题。 伴随着测序技术的发展， 整个社会的道德方面也要同时处理好才能使测序更好的造福人类。