转录组背景、环境设置(目录管理)

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文献学习 【要做笔记】
1.A comprehensive evaluation of normalization methods for illuminating high-thoughput RNA sequencing data analysis

  1. Methods to study splicing from high-throughput RNA sequencing data
  2. survey of best practices for RNA-seq data analysis
  3. hppRNA-a snakelike-based handy parameter-free pipeline for RNA-seq
    analysis of numerous samples
  4. Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by
    performing a broad-spectrum RNA-seq analysis
    • RNA sequencing: the teenage years

1.阐明高通量RNA测序数据分析的标准化方法的综合评价
2.方法从高通量RNA测序数据中研究剪接
3.RNA-seq数据分析的最佳实践调查
4.hpprna -一种基于蛇形的方便的无参数的RNA-seq分析管道,用于众多样本

5.通过执行广谱RNA-seq分析,获得对转录组的全面生物学见解

 

转录组的最佳实践

1.实验设计    2.测序设计                         3.质控
核心部分主要是:定量,差异表达分析,解释

更进一步就是联合

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应用

  • 差异表达基因
    Drug treated vs. untreated cell line
    Wild type versus knock out organism               
  •  药物治疗与未治疗的细胞系
  • 野生型还是破坏型
  • 发现新的转录本
  • RNA编辑
  • 可变剪接
  • LncRNA鉴定
  • 基因融合
  • SNP Indel

分析策略

如何选择软件?如何选择参数【要找综述进行参考】!

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公司的pipline

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实验流程图

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1.为何要打断?【技术限制,只能测短的】
2.为啥要反转录生成cDNA呢?【RNA不够稳定】

 

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文库:连接好接头的cDNA,叫做文库,英文为library

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index:一段特定的序列,标记不同来源的样本
6-8个碱基
read2测序引物结合位点:在Index序列的旁边GAT

文库质控

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如何看图?【如果降解了就会被打断,5‘被打断了,5就变短了】

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------------------------------------分割线-------------------------------------------------------------------------------------------

SBS(Sequencing-By-Synthesis):

通过单分子阵列实现在小型芯片(Flowcell)上进行桥式PCR反应。通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基,再利用四种带有不同荧光标记的碱基,通过荧光激发/捕获,读取碱基信息基于可逆终止的、荧光标记dNTP,边合成边测序

叠氮集团

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双端测序(容易理解错)

DNA链,除了正向读一遍,还可以从DNA的负向读一遍
将DNA测序的有效长度加长了一倍
Forward strand:read1
Reverse Strand:read2,3'端引物

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目录管理

 示例如下:tree -L 1
├── biosoft #软件安装目录
├── database #数据库存放目录,包括参考基因组,注释文件,公共数据库等
├── pipline #流程搭建目录
├── project #项目分析目录
└── project_backup #数据备份目录
# 进入到个人目录
cd ~

## 1.建立数据库目录
mkdir database
# 在数据库下建立参考基因组数据库,注意命名习惯:数据库名字/物种名字/参考基因组版本信息
mkdir -p database/genome/Ensembl/Homo_sapiens/GRCh38_release95

## 2.建立软件安装目录
mkdir biosoft

## 3.建立项目分析目录
mkdir project
cd project
# 注意项目命名习惯:物种-样本数-疾病-分析流程
mkdir Human-16-Asthma-Trans
circRNA
sRNA
lncRNA
RRBS
tumorExome

## 4.建立数据备份目录
mkdir project_backup
# 哪天备份就在那个日期文件夹,非常有利于项目溯源
cd project_backup
mkdir 20200904
# 在project_backup下放一个所有备份数据路径的txt文件,方便快速查找项目
touch project_backup_all_220200904_update.xls
用vim 编辑,粘贴项目路径


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安装前记得激活小环境

# 每次运行前,激活创建的小环境rna
conda activate rna

cd software/
conda install -c hcc aspera-cli

判断安装成功
输入asc,按tab键补全ascp,

ascp -h #出来帮助文档

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