Applications for PacBio circular consensus sequencing

PacBio 循环共有测序的应用

发表于 2013 年 2 月 11 日 通过 lexnederbragt 

我是 Pacific Biosciences PacBio RS 测序仪的粉丝，本博客的一些读者可能已经知道。 我们在工作中使用该仪器的数据，我所属的挪威测序中心 向其用户提供该技术 。

PacBio 最近 增加了他们的阅读长度 。 使用这种所谓的 C2XL 化学，平均原始长度现在约为 4.3-4.5 kbp，最大读取长度可以超过 20kbp。 这些超长读取非常适合 从头 基因组测序应用，这是我们自己正在尝试的。 然而，在关于这些更长读取的新闻中有点隐藏的是 PacBio 所谓的循环共识测序或 CCS 的后果。

什么是 CCS？
为了理解 CCS，需要对 PacBio 测序有所了解。 熟悉这一点的读者可以跳到下一节。

PacBio 测序的模板是所谓的 SMRTBell。 这些是通过将发夹接头连接到双链 DNA 分子的两端而产生的。 看图
发夹接头有一个用于测序的启动位点，用于测序的聚合酶具有链置换能力（它基本上不关心它是否必须通过双链区域，它只是“启动”相反的链）。 这样做的效果是序列模板 (SMRTBell) 的作用就像一个单链闭环。 酶在引物位置开始测序，并对模板进行测序，直到它掉下来，或者作为荧光激发的副作用被“杀死”。 如果酶有足够长的寿命和足够短的插入物，酶实际上会绕过 SMRTBell 另一端的发夹。 对于最短的刀片，它可能会绕圈多次。

用于 PacBio 测序的 SMRTBell 模板的示意图。 来自 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2926623/ 

这种多遍测序允许调用插入序列的共识，克服了该技术的高单遍错误率（由 PacBio 引用 为~11% 的中值错误率 ）。 为了在 CCS 模式下成功测序，插入片段必须短且聚合寿命长。 软件至少需要三遍才能考虑调用共识，最好五遍或更多才能达到 99% 的准确率（Q20）或更好。 一个重要方面是 PacBio 测序的原始读取长度分布（见下图）。 三遍或更多遍的要求限制了刀片尺寸。 例如，需要 3 kbp 的原始读取来获得 1 kbp 插入的共识。 因此，总会有一个——显着的！ – 不会产生共识读取的原始读取的一小部分，因为它们太短了。 因此，每个 SMRTCell（“芯片”）的有用读取数低于对长读取（单程）测序有用的原始读取数。

 

典型的 PacBio C2Xl 原始读取长度分布。 来自 http://pacificbiosciences.com/brochure（2013 年 2 月）

CCS 和新的超长原始读取
从上面可以看出，原始读取长度的增加允许 CCS 读取的插入文库更长，或者更短的插入 CCS 文库的吞吐量更高。 PacBio 过去建议 CCS 文库使用 500bp 到 1kbp 的范围。 随着 C2XL 读取长度的增加，这将翻倍至 1-2 kbp。 每个 SMRTCell 的吞吐量约为 40 000 次读取。 本文的其余部分描述了这些超长共识读取可能有用的三个可能领域。

免责声明
首先，我可能是 PacBio 的粉丝，该公司正在帮助我们完成基因组项目，但我没有从他们那里获得任何经济或其他个人利益。 我在这里写的是我自己的看法。 其次，以下建议未经我或我的同事测试——尽管其他人可能正在沿着这些思路工作。 因此，需要确定建议的 CCS 如何使用我描述的实际工作。

1) 用于测序全长 16S rRNA 的 CCS
在下一代测序之前，人们习惯于扩增样本的 16S 区域并制作细菌克隆文库，使用 Sanger 测序对一组克隆进行测序。 NGS 允许每个样本进行更多读取，但将测序部分的长度限制在最多几百个碱基。 因此，NGS 产生了更深的测序数据集，但区分能力较低（系统发育/分类信号较少）。
PacBio 现在可以实现长 CCS 读取，这意味着人们可以考虑回到全长 16S 测序。 吞吐量（每个 SMRTCell 40 000 条读取）将远高于使用 Sanger 测序所能达到的水平，而且质量可能甚至优于 Sanger。 但是，每次读取的价格将明显高于使用短读取技术。 我认为对于某些多样性研究，使用带有全长 16S 扩增子的 PacBio CCS 将非常有益。

2) 用于鸟枪法宏基因组学的 CCS
同样，对全样本鸟枪法宏基因组学（而不是基于 PCR 的多样性研究）感兴趣的人可以考虑使用 1-2 kbp CCS 读数。 例如，长读取可以为基因挖掘提供更多有用的信息。 有人可能会建议使用 Roche/454 GS FLX+，它现在似乎正在工作——至少在我们的实验室中是这样——将在该长度附近产生更多的读取（1 到 120 万）（我们已经看到 1kb 模式读取长度与GS FLX+！），使这项技术更具成本效益。 使用挪威测序中心的价格进行的一些粗略计算表明，这种比较实际上有利于 PacBio。 鉴于一个文库制备和 100 万条所需的读取，454 目前的价格被 PacBio 高出，而后者有可能提供更好的质量（无均聚物错误）和更长的读取。 然而，首先，生成 100 万个 CCS 读数（25 个 SMRTCells）比完整的 454 次运行（大约一天）需要更多的时间（几天，不包括文库准备）[请注意，实验室团队不希望对 PacBio 进行乳液 PCR CCS！]。 其次，其他中心的定价情况可能不同（我认为不同中心的定价结构确实不同）。

3）CCS代替Sanger毛细管板测序
桑格测序 远未消亡 。 它的主要吸引力在于它允许非常小的样本量（可以将单个样本提交给设施）和高质量的长读取。 Sanger 和 NGS 之间的一个关键区别在于，每个读数都可以追溯到板上的孔。 我认为，如果可以为多路 PacBio CCS 测序设计一个合适且具有成本效益的条形码方案，PacBio CCS 可能会取代 Sanger 板测序。 为了降低成本，需要大规模复用，可能需要数十个 96 孔板，其中的碎片需要追踪到其原始板和孔。 但是具有良好自动化经验的实验室可能会成功。 同时，该方案需要源源不断的桑格样本。 它不适用于测序少于每周十几个盘子的设施。 商业供应商实际上可能已经考虑进行此转换。 与 Sanger 相比，其好处可能是更长的读取时间，具有更高的每个碱基质量。

[技术说明：每个 SMRTCell 40 000 次读取的吞吐量可能允许多次添加相同的模板，从而提高最终共识的准确性。 原始读数的一小部分太短而无法达成共识（见上文）实际上可能有助于质量以及它们是条形码]
总而言之：PacBio CCS 可能是短读长测序甚至 Sanger 毛细管测序的替代方案。 但是，信息内容与每次阅读的价格之间存在权衡。

有关描述 CCS 的技术性但可读性很强的论文（来自 PacBio 研究人员自己），请参阅 这篇论文 。