关于RiboSeq分析流程的总结-持续更新

已于 2024-07-15 23:25:06 修改
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分类专栏： shell 文章标签： linux
于 2024-07-13 22:21:11 首次发布
版权声明：本文为博主原创文章，遵循 CC 4.0 BY-SA 版权协议，转载请附上原文出处链接和本声明。
本文链接：https://blog.csdn.net/weixin_44231554/article/details/140407298
版权

最近关注了一下RiboSeq的分析方法，方法挺多的，但是无论哪种软件，都会存在或多或少的问题，一点问题不存在的软件不存在，问题的原因出在，1.有的脚本是用python2编写的，目前python2已经不能用了 2.有的没有安装权限 3.有的package过于老旧已经和python3不兼容了

1.RiboTaper

按照官方流程分析

1.1 直接运行：create_annotations_files.bash

1.2 直接运行：create_metaplots.bash

1.3 直接运行：Ribotaper.sh

这一步脚本的步骤比较多，并且中途会报错，接下来就需要自己调整脚本运行了：
3.1

nohup /datapool/life-zhanghk/liji/01software/miniconda3/envs/py3.8/libexec/tracks_analysis_multiprocessing.R nonccds 10 /datapool/life-zhanghk/liji/01software/miniconda3/envs/py3.8/libexec &

nohup /datapool/life-zhanghk/liji/01software/miniconda3/envs/py3.8/libexec/annotate_exons.R ../annotation/ 10 &

#这个因为后面报错太多，无法解决直接给放弃了

2.RiboCode

Ribosome profiling技术有两个不同的应用方向：翻译速率的定量比较与翻译事件的系统鉴定。此前，杨雪瑞课题组开发了ribosome profiling数据分析工具Xtail，用于基因翻译速率的定量比较，文章发表于Nature Communications（文章链接）。此次发表的RiboCode工具则针对第二个应用方向：鉴定RNA翻译活性并构建翻译组。
由于这个软件是18年发表的，虽然中间经过小的维护，但是里面仍然有大部分package是过期了，如果现在使用，需要做大量的调整，但是这个调整也是值得的，因为这个软件总体来说还是比较好用的，因为相对于其他software，这个是属于操作流程很详细了，我把大致步骤放在下面，有需要可以去作者github看详细操作流程
1.fastp过滤接头即可，比较简单（和作者给出的方法不同，但是都能达到相同的目的）
2.去除rRNA和tRNA的干扰，建议使用bowtie建立索引和比对，注意不是bowtie2，因为RiboSeq的片段大都是30nt左右，bowtie在短序列比对方面有更大的优势
3.使用上一步的unaligned.fastq作为输入文件，这一步继续使用bowtie进行mapping

4.prepare_transcripts

参数解读：
你运行的命令显示了 prepare_transcripts 脚本的帮助信息。这些参数用于准备转录本注释文件。以下是每个参数的详细解读：

命令行参数说明

基本参数

  • -h, --help

    • 描述: 显示帮助信息并退出。
    • 用法: prepare_transcripts -h

  • -V, --version

    • 描述: 显示程序的版本号并退出。
    • 用法: prepare_transcripts -V
必需参数

  • -g GTFFILE, --gtf GTFFILE

    • 描述: 默认情况下，适用于 GENCODE 和 ENSEMBL 的 GTF 文件，请参阅 GENCODE 维基百科，或者使用 GTFupdate 命令更新您的 GTF 文件。
    • 用法: -g /path/to/gtf_file.gtf

  • -f GENOMEFASTA, --fasta GENOMEFASTA

    • 描述: 基因组序列文件，格式为 FASTA。
    • 用法: -f /path/to/genome.fasta

  • -o OUT_DIR, --out_dir OUT_DIR

    • 描述: 注释目录名称。
    • 用法: -o /path/to/output_directory

示例用法

以下是一些命令行示例，展示如何使用这些参数：

prepare_transcripts -g /path/to/gtf_file.gtf -f /path/to/genome.fasta -o /path/to/output_directory

这个命令将使用指定的 GTF 文件和基因组序列文件运行 prepare_transcripts，并将结果输出到指定的目录中。

总结

该脚本主要用于准备转录本注释文件，生成的注释文件将用于后续的转录组数据分析。你需要提供 GTF 文件和基因组序列文件，并指定输出目录。确保这些文件存在且路径正确，然后运行命令生成注释文件。

5.metaplot

参数解读：
你运行的命令显示了 metaplots 脚本的帮助信息。这些参数用于生成 metaplot 文件并预测 P-site 位置。以下是每个参数的详细解读：

命令行参数说明

基本参数

  • -h, --help

    • 描述: 显示帮助信息并退出。
    • 用法: metaplots -h

  • -V, --version

    • 描述: 显示程序的版本号并退出。
    • 用法: metaplots -V
必需参数
  • -a ANNOT_DIR, --annot_dir ANNOT_DIR
    • 描述: 转录本注释目录，由 prepare_transcripts 生成。
    • 用法: -a /path/to/annotation_directory
选择性必需参数（需选择其一）

  • -r RPF_MAPPING_FILE, --rpf_mapping_file RPF_MAPPING_FILE

    • 描述: 转录组对齐的 ribo-seq BAM/SAM 文件。
    • 用法: -r /path/to/rpf_mapping_file.bam

  • -i RPF_MAPPING_FILE, --input_file RPF_MAPPING_FILE

    • 描述: 列出转录组对齐的 ribo-seq BAM/SAM 文件的文件。
    • 用法: -i /path/to/rpf_file_list.txt
可选参数

  • -s {yes,reverse,no}, --stranded {yes,reverse,no}

    • 描述: 数据是否为链特异性，reverse 表示反向链解释。（默认值: yes）
    • 用法: -s yes

  • -m MINLENGTH, --minimum-length MINLENGTH

    • 描述: 输出的读取的最小长度，默认值为 24。
    • 用法: -m 24

  • -M MAXLENGTH, --maximum-length MAXLENGTH

    • 描述: 输出的读取的最大长度，默认值为 36。
    • 用法: -M 36

  • -pv1 PVALUE1_CUTOFF, --pvalue1_cutoff PVALUE1_CUTOFF

    • 描述: 用于自动预测 P-site 位置的 frame0 > frame2 的 p 值截断值，默认值为 0.05。
    • 用法: -pv1 0.05

  • -pv2 PVALUE2_CUTOFF, --pvalue2_cutoff PVALUE2_CUTOFF

    • 描述: 用于自动预测 P-site 位置的 frame0 > frame2 的 p 值截断值，默认值为 0.05。
    • 用法: -pv2 0.05

  • -f0_percent FRAME0_PERCENT, --frame0_percent FRAME0_PERCENT

    • 描述: frame0 中读取数量的比例阈值，定义为 f0/(f0+f1+f2)，默认值为 0.2。
    • 用法: -f0_percent 0.2

  • -o OUTNAME, --outname OUTNAME

    • 描述: 输出 PDF 文件的名称（默认值: metaplots）。
    • 用法: -o metaplots

示例用法

以下是一些命令行示例，展示如何使用这些参数：

metaplots -a /path/to/annotation_directory -r /path/to/rpf_mapping_file.bam -o my_metaplots

metaplots -a /path/to/annotation_directory -i /path/to/rpf_file_list.txt -s reverse -m 20 -M 30 -pv1 0.01 -pv2 0.01 -f0_percent 0.25 -o my_metaplots

这些命令将使用指定的注释目录和 BAM/SAM 文件运行 metaplots，并将结果输出到指定的文件名。根据需要启用或禁用特定选项以适应不同的分析需求。

6.Ribocode

参数解读：

你在 RiboCode 命令行下运行 -h 选项，已经成功显示了帮助信息。以下是每个参数的详细解读：

命令行参数说明

基本参数

  • -h, --help

    • 描述: 显示帮助信息并退出。
    • 用法: RiboCode -h

  • -V, --version

    • 描述: 显示程序的版本号并退出。
    • 用法: RiboCode -V
必需参数

  • -a ANNOT_DIR, --annot_dir ANNOT_DIR

    • 描述: 转录本注释目录，由 prepare_transcripts 生成。
    • 用法: -a /path/to/annotation_directory

  • -c CONFIG_FILE, --config_file CONFIG_FILE

    • 描述: 列出 BAM 文件和 P-位点信息的配置文件，请参阅数据文件夹中的示例文件。
    • 用法: -c /path/to/config_file
可选参数

  • -l {yes,no}, --longest-orf {yes,no}

    • 描述: 默认值为 yes，从最远的 AUG 到终止的区域被定义为 ORF。如果设置为 no，起始密码子的位置将由程序自动确定。
    • 用法: -l yes

  • -s START_CODON, --start_codon START_CODON

    • 描述: 规范的起始密码子。默认值为 ATG。
    • 用法: -s ATG

  • -A ALTERNATIVE_START_CODONS, --alt_start_codons ALTERNATIVE_START_CODONS

    • 描述: 替代的起始密码子，如 CTG, GTG，默认值为 None。多个密码子应以逗号分隔。
    • 用法: -A CTG,GTG

  • -S STOP_CODON, --stop_codon STOP_CODON

    • 描述: 终止密码子，默认值为 TAA,TAG,TGA。
    • 用法: -S TAA,TAG,TGA

  • -t TRANSL_TABLE, --transl_table TRANSL_TABLE

    • 描述: ORF 翻译表（默认值：1）。根据你的生物体指定正确的遗传代码。
    • 用法: -t 1

  • -m MIN_AA_LENGTH, --min-AA-length MIN_AA_LENGTH

    • 描述: 预测的多肽的最小长度，默认值为 5。
    • 用法: -m 5

  • --dependence_test {none,mic,pcc}

    • 描述: 用于测量框架1和框架2之间依赖性的方法。此测试可以帮助确定组合 p 值是否应调整以考虑两个测试之间的依赖性。mic: 最大信息系数；pcc: 皮尔逊相关系数。
    • 用法: --dependence_test mic

  • --stouffer_adj {none,nyholt,liji,gao,galwey}

    • 描述: 调整组合 p 值以考虑两个测试之间依赖性的方法。详情请参阅：Stouffer 方法调整。
    • 用法: --stouffer_adj nyholt

  • -p PVAL_CUTOFF, --pval-cutoff PVAL_CUTOFF

    • 描述: ORF 过滤的 p 值截断值，默认值为 0.05。
    • 用法: -p 0.05

  • --pval_adj {fdr_bh,bonferroni,sidak,holm-sidak,holm,simes-hochberg,hommel,fdr_by,fdr_tsbh,fdr_tsbky}

    • 描述: 用于校正多重测试 p 值的方法。默认值：Benjamini/Hochberg 方法。详情请参阅：多重测试 p 值校正。
    • 用法: --pval_adj fdr_bh

  • -g, --output-gtf

    • 描述: 输出预测的 ORF 的 GTF 文件。
    • 用法: -g

  • -b, --output-bed

    • 描述: 输出预测的 ORF 的 BED 文件。
    • 用法: -b

  • -o OUTPUT_NAME, --output-name OUTPUT_NAME

    • 描述: 输出文件名称，默认值为 final_result。
    • 用法: -o final_result

示例用法

以下是一些命令行示例，展示如何使用这些参数：

RiboCode -a /path/to/annotation_directory -c /path/to/config_file -o my_output

RiboCode -a /path/to/annotation_directory -c /path/to/config_file -l no -s ATG -A CTG,GTG -S TAA,TAG,TGA -t 1 -m 10 --dependence_test mic --stouffer_adj nyholt -p 0.01 --pval_adj bonferroni -g -b -o my_output

这些命令将使用指定的注释目录和配置文件运行 RiboCode，并将结果输出到指定的文件名。根据需要启用或禁用特定选项以适应不同的分析需求。

7.plot_orf_density

参数解读：
plot_orf_density 脚本的用途是绘制指定 ORF 的 P-site 图谱。以下是每个参数的详细解读：

命令行参数说明

基本参数

  • -h, --help

    • 描述: 显示帮助信息并退出。
    • 用法: plot_orf_density -h

  • -V, --version

    • 描述: 显示程序的版本号并退出。
    • 用法: plot_orf_density -V
必需参数

  • -a ANNOT_DIR, --annot_dir ANNOT_DIR

    • 描述: 转录本注释目录，由 prepare_transcripts 生成。
    • 用法: -a /path/to/annotation_directory

  • -c CONFIG_FILE, --config_file CONFIG_FILE

    • 描述: 定义 BAM 文件信息的配置文件，请参阅数据文件中的示例文件。
    • 用法: -c /path/to/config_file

  • -t TRANSCRIPT_ID, --transcript_id TRANSCRIPT_ID

    • 描述: 转录本的 ID。
    • 用法: -t transcript_id

  • -s ORF_TSTART, --orf_tstart ORF_TSTART

    • 描述: ORF 的起始位置（转录本水平坐标）。
    • 用法: -s orf_start_position

  • -e ORF_TSTOP, --orf_tstop ORF_TSTOP

    • 描述: ORF 的结束位置（转录本水平坐标）。
    • 用法: -e orf_stop_position

  • --start-codon STARTCODON

    • 描述: 预测 ORF 的起始密码子。
    • 用法: --start-codon ATG
可选参数

  • -o OUTNAME, --outname OUTNAME

    • 描述: 输出文件名，默认为 transcriptid_tstart_tstop.pdf。
    • 用法: -o output_file_name

  • --plot-annotated-orf PLOTANNOTATEDORF

    • 描述: 是否绘制注释的 ORF (yes 或 no)。
    • 用法: --plot-annotated-orf yes

示例用法

以下是一些命令行示例，展示如何使用这些参数：

plot_orf_density -a /path/to/annotation_directory -c /path/to/config_file -t transcript_id -s 100 -e 500 --start-codon ATG --plot-annotated-orf yes -o output_file.pdf

这个命令将使用指定的转录本注释目录和配置文件，以及提供的转录本 ID、ORF 起始位置和结束位置，生成 ORF 的 P-site 图谱，并保存为 output_file.pdf。

8.ORFcount

参数解读：
ORFcount 脚本用于计算与 ORF 对齐的 SAM/BAM 格式的比对文件中的读取数量，以及使用 GTF 格式的特征文件。以下是每个参数的详细解读：

命令行参数说明

基本参数

  • -h, --help

    • 描述: 显示帮助信息并退出。
    • 用法: ORFcount -h

  • -V, --version

    • 描述: 显示程序的版本号并退出。
    • 用法: ORFcount -V
主要参数

  • -s {yes,reverse,no}, --stranded {yes,reverse,no}

    • 描述: 指定数据是否为链特异性，yes 表示正链，reverse 表示反链，no 表示非链特异性。（默认：yes）
    • 用法: -s yes

  • -a MIN_QUALITY, --minaqual MIN_QUALITY

    • 描述: 跳过比对质量低于给定最小值的所有读取。（默认：10）
    • 用法: -a 10

  • -c {union,intersection-strict}, --count_mode {union,intersection-strict}

    • 描述: 处理与多个 ORF 重叠的读取的模式，选项包括 union 和 intersection-strict。（默认：intersection-strict）
    • 用法: -c intersection-strict

  • -g GTF_FILE, --gtf GTF_FILE

    • 描述: 由 RiboCode 生成的 ORF GTF 文件。（默认：final_result）
    • 用法: -g final_result.gtf

  • -r RPF_MAPPING_FILE, --rpf_mapping_file RPF_MAPPING_FILE

    • 描述: 对齐到基因组的 ribo-seq BAM/SAM 文件，多个文件应以逗号分隔。
    • 用法: -r file1.bam,file2.bam
可选参数

  • -f FIRST_EXCLUDE_CODONS, --first_exclude_codons FIRST_EXCLUDE_CODONS

    • 描述: 排除与 ORF 的前几个密码子对齐的读取。（默认：15）
    • 用法: -f 15

  • -l LAST_EXCLUDE_CODONS, --last_exclude_codons LAST_EXCLUDE_CODONS

    • 描述: 排除与 ORF 的最后几个密码子对齐的读取。（默认：5）
    • 用法: -l 5

  • -e EXCLUDE_MIN_ORF, --exclude_min_ORF EXCLUDE_MIN_ORF

    • 描述: 排除与 ORF 前后几个密码子对齐的读取的 ORF 的最小长度（nt）。（默认：100）
    • 用法: -e 100

  • -m MIN_READ, --min_read MIN_READ

    • 描述: 计数 RPF 的最小读取长度。（默认：26）
    • 用法: -m 26

  • -M MAX_READ, --max_read MAX_READ

    • 描述: 计数 RPF 的最大读取长度。（默认：34）
    • 用法: -M 34

  • -o OUTPUT_FILE, --output OUTPUT_FILE

    • 描述: 将所有 ORF 计数写入文件，默认是写入标准输出。
    • 用法: -o output_file.txt

示例用法

以下是一些命令行示例，展示如何使用这些参数：

ORFcount -s yes -a 10 -c intersection-strict -g final_result.gtf -r sample1.bam,sample2.bam -f 15 -l 5 -e 100 -m 26 -M 34 -o orf_counts.txt

这个命令将使用指定的链特异性、最小比对质量、计数模式、GTF 文件和 BAM 文件，并排除指定位置的读取，最终将 ORF 计数结果保存到 orf_counts.txt 文件中。

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