感受态细胞制备与质粒转化--实验操作系列-6

感受态细胞制备与质粒转化操作手册

实验室常用抗生素配制--实验操作系列-3

常见液体培养基的配置-实验操作系列-5

1. 感受态细胞制备

1.1 试剂准备

• 配制所需试剂：

  • 1 L LB（液体培养基）

  • 200mL LB（固体培养基）， 倒20个板（无抗）

  • 1 L 100 mM CaCl₂

  • 1 L 100 mM MgCl₂

  • 100 mL 85 mM CaCl₂ + 15% 甘油（V/V）

• 所有试剂及离心管/瓶需高压灭菌（121°C，20min）

1.1.1 配置 1 L 100 mM MgCl₂ 溶液

材料准备

• MgCl₂·6H₂O（六水氯化镁）：需要根据其摩尔质量计算用量。

  • MgCl₂·6H₂O 的摩尔质量为 203.3 g/mol。

• 去离子水：1 L。

配置步骤

1. 称取 MgCl₂·6H₂O：称取 20.33 g MgCl₂·6H₂O。

2. 溶解：将 MgCl₂·6H₂O 加入 800-900 mL 去离子水中，充分搅拌至完全溶解。

3. 定容：将溶液转移到 1 L 容量瓶中，用去离子水补至 1 L 刻度线。

4. 储存：转移到干净的试剂瓶中，贴上标签，标明浓度和日期，可储存于室温或 4℃。

1.1.2 配置 100 mL 85 mM CaCl₂ + 15% 甘油（V/V）溶液

材料准备

• CaCl₂·2H₂O（二水氯化钙）：根据摩尔质量计算用量。

  • CaCl₂·2H₂O 的摩尔质量为 147.01 g/mol。

• 甘油（Glycerol）：需占最终溶液体积的 15%。

• 去离子水：补足至 100 mL。

配置步骤

1. 称取 CaCl₂·2H₂O：称取 1.249 g CaCl₂·2H₂O。

2. 准备甘油溶液：量取 15 mL 甘油。

3. 混合：将 CaCl₂·2H₂O 加入 70-80 mL 去离子水中，搅拌至完全溶解后，加入 15 mL 甘油（灭菌）。

4. 定容：用去离子水补至 100 mL。

5. 储存：将溶液转移到干净的试剂瓶中，贴上标签，标明浓度和日期，储存于 4℃。

1.2 菌种接种

1. 将菌种从 -80℃ 冻存库中取出，在冰面上解冻。

2. 置于 37℃ 摇床中复苏 30-45 分钟。

3. 使用接种环或涂布棒，将菌液划线接种至 LB 平板。

4. 在 37℃ 恒温培养箱中培养：

   • 正置 15-30 分钟；

   • 倒置培养过夜（12-16 小时）。

1.3 扩大培养

1. 取单菌落，接种至含 0.5 mL LB 培养基的 1.5 mL EP 管中，培养 4-6 小时。

2. 按 1:1000 的比例将菌液转入 LB 培养基中进行扩大培养。

3. 在 37℃ 恒温培养箱中培养 12-16 小时（建议新手控制在 10 小时以内）。

1.4 感受态细胞制备

1. 评估菌种 OD 值：

   • 接种培养 10 小时后，每小时测量 OD₆₀₀；

   • 当 OD₆₀₀ 超过 0.2 时，每 15-20 分钟测量一次。

2. 停止培养：

   • 当 OD₆₀₀ 达到 0.35-0.4 时，立即将培养物置于冰上冷却 20-30 分钟。

3. 离心收集细菌沉淀：

   • 4℃，3000g（或约 4000 rpm）离心 15 分钟，弃上清液。

4. MgCl₂ 重悬（可选步骤，提升细胞膜通透性）：

   • 用冰冷的 100 mM MgCl₂ 重悬细菌沉淀（100 mL MgCl₂ 对应 250 mL 菌液），轻柔吹散沉淀。

5. CaCl₂ 孵育：

   • 使用 100 mM 冰冷 CaCl₂ 重悬细菌沉淀，冰浴孵育 30-60 分钟。

6. 细胞预处理：

   • 用 85 mM CaCl₂ + 15% 甘油（V/V）重悬沉淀，离心后重复一次。

7. 制备冻存感受态细胞：

   • 使用 85 mM CaCl₂ + 15% 甘油（V/V）重悬沉淀，分装至 1.5 mL EP 管（每管 100 μL）。

   • 立即置于液氮中保存，最终转存于 -80℃ 冻存。

8. 转化效率验证：

   • 转化荧光质粒，提取并观察荧光或进行 PCR 检验。

2. 质粒转化

2.1 操作步骤

1. 感受态细胞解冻：

   • 从 -80℃ 冻存库取出感受态细胞，置于冰面上解冻。

2. 质粒与感受态细胞混合：

   • 将目的质粒与解冻后的感受态细胞轻柔混匀。

3. 冷激：

   • 将混合物置于冰浴中孵育 25-30 分钟。

4. 热激：

   • 在 42℃ 水浴锅中热激 45 秒（促进外源 DNA 进入感受态细胞）。

5. 恢复（Recover）：

   • 将热激后的混合物置于冰浴中孵育 2 分钟。

6. 复苏：

   • 加入无抗生素的 LB 液体培养基，37℃，220 rpm 摇床复苏 60 分钟。

7. 涂布：

   • 根据质粒大小或转化难易程度，选择是否离心后涂布于抗性 LB 平板（卡那 or 氨苄）。

3. 总结与注意事项

• 严格无菌操作：整个过程需保证无菌环境。

• 低温环境操作：停止培养后，所有步骤均需在冰冷环境中进行。

• 优化关键条件：如酶处理时间、温度和离心参数。

• 验证与记录：每批次感受态细胞均需通过转化效率测试验证合格。

该流程为感受态细胞制备与质粒转化提供了详细的操作参考，可适用于多种基因克隆实验。