【无标题】

碱基识别的几种偏差

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前言

提示：这里可以添加本文要记录的大概内容：

下一代测序平台正在显着降低 DNA 测序的成本。使用这些技术，碱基是从光强度信号中推断出来的，这个过程通常被称为碱基调用（base-calling）。
主要参考的文章是2011.9的一篇文章，可能内容有点过时。

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提示：以下是本篇文章正文内容，下面案例可供参考

一、illumina的测序原理

原理：基于可逆终止的，荧光标记的dNTP，来做边合成边测序的工作。

flowcell：8条通道，内表面做了专门的化学修饰。 两种dna引物，种在玻璃表面。和文库的接头序列互补，通过共价键连接。

构建DNA文库：DNA文库即很多的DNA片段，两端有固定的接头。
特点1：插入的dna序列是各种各样的
特点2：两头的序列是人工加上去的

制作过程：
	1 把基因组dna用超声波打断
	2 两头用酶补平
	3 用酶在3‘端加一个A碱基
	4 用连接酶连接到接头上	 

桥式PCR
https://www.bilibili.com/video/BV1Y54y1Q79E?share_source=copy_web

测序：
通过荧光标记的dNTP和聚合酶，每个循环放到显微镜下进行激光扫描，根据荧光判断碱基。

数据分析

二、illumina平台存在的几种偏差

1 Mixed cluster

虽然英文是Mixed cluster，但是我觉得应该就是多克隆cluster。
即本来一簇cluster应该是一个模板长出来的，但是多克隆cluster是多个模板长出来的，发出的信号是杂乱的。

2 Phasing

一个循环中，某一个链没接上碱基，相比其他链来说少了一个碱基。

3 Pre-phasing

一个循环中，某一个链多接了一个碱基，接了两个碱基。相比其他链来说多了一个碱基。
同上图。

4 T fluophore accumulation

因为早期化学方面的原因，T染料裂解不完全，会导致T的累积。

5 光学原因

cross-talk & boundary effects
cross-talk 串扰 四种染料对应的发射光谱部分重叠。同一个波长，几个荧光染料都有贡献。
boundary effects 边界效应 每个Tile的强度是不均匀的，边缘处的强度比较低。
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参考：
下一代测序平台的碱基调用
b站视频
桥式PCR
陈巍学基因

总结

第一次写，有很多地方会有瑕疵，请大家多多指正。