illumina测序的一些注意事项

在二代测序领域，illumina测序平台以其核心的三项技术（分别是碱基末端可逆修饰、桥式PCR和边合成变测序策略），独步天下。充分发挥了其碱基读取精确、通量提高、测序长度也稳步提高至双末端各300bp。但是，任何测序技术面对各种测序需求总是会有些许不足，大白话说就是：没有哪项技术可以解决全部的问题。那么，illumina测序有哪些问题是需要注意的呢？我们就来聊聊这个话题。
问题一、测序过程中必须碱基平衡
所谓碱基平衡，是指，测序芯片上完成成簇反应之后，一定面积内的不同分子簇，各个位置的碱基A、T、G、C分布均匀。这样才可以较好的完成信号转换。如若不然，那么对于碱基的判读就会出现错误，从而导致测序质量值大幅度下降。
反应在测序文库上，就是一次测序反应中，应该尽量多添加诸如基因组DNA文库，RNA转录组文库，而少掺入一些扩增子文库。这里的扩增子文库是指类似16s/18s/ITS可变区文库。如果实在凑不齐文库，那么就应该认为掺入大量的平衡碱基文库。包括phix文库、基因组文库等。同时，也可以尽量多掺入不同类型的扩增子文库。或者，对扩增子文库的barcode序列做一些错位（spacer）设计，增加碱基的平衡性。

上图即是平衡文库和非平衡文库测序数据差别，其中碱基不平衡文库曲线非常糟糕，数据质量会很差。
问题二、读取长度受限
尽管目前illumina的测序读长已经达到双末端300bp，但是想要进一步提高测序读长，还是非常困难的。主要的原因在于，第