在二代测序领域,illumina测序平台以其核心的三项技术(分别是碱基末端可逆修饰、桥式PCR和边合成变测序策略),独步天下。充分发挥了其碱基读取精确、通量提高、测序长度也稳步提高至双末端各300bp。但是,任何测序技术面对各种测序需求总是会有些许不足,大白话说就是:没有哪项技术可以解决全部的问题。那么,illumina测序有哪些问题是需要注意的呢?我们就来聊聊这个话题。
问题一、测序过程中必须碱基平衡
所谓碱基平衡,是指,测序芯片上完成成簇反应之后,一定面积内的不同分子簇,各个位置的碱基A、T、G、C分布均匀。这样才可以较好的完成信号转换。如若不然,那么对于碱基的判读就会出现错误,从而导致测序质量值大幅度下降。
反应在测序文库上,就是一次测序反应中,应该尽量多添加诸如基因组DNA文库,RNA转录组文库,而少掺入一些扩增子文库。这里的扩增子文库是指类似16s/18s/ITS可变区文库。如果实在凑不齐文库,那么就应该认为掺入大量的平衡碱基文库。包括phix文库、基因组文库等。同时,也可以尽量多掺入不同类型的扩增子文库。或者,对扩增子文库的barcode序列做一些错位(spacer)设计,增加碱基的平衡性。
上图即是平衡文库和非平衡文库测序数据差别,其中碱基不平衡文库曲线非常糟糕,数据质量会很差。
问题二、读取长度受限
尽管目前illumina的测序读长已经达到双末端300bp,但是想要进一步提高测序读长,还是非常困难的。主要的原因在于,第
illumina测序的一些注意事项
最新推荐文章于 2023-03-26 12:33:31 发布
![](https://img-home.csdnimg.cn/images/20240711042549.png)