GPB最新专辑Microbiome and Health在线发表华中科技大学生命科学与技术学院宁康课题组、中国科学院测量与地球物理研究所王智课题组和美国芝加哥大学微生物中心Jack A Gilbert课题组（现单位为美国加州大学圣地亚哥分校）题为“Agricultural Risk Factors Influence Microbial Ecology in Honghu Lake”的研究论文。我们的“要文译荐”栏目很高兴邀请到第一作者韩毛振博士亲自为大家解读农业生产活动对洪湖水体微生态的影响。
背景
水生生态系统，特别是内陆湖泊的生态系统，是环境微生态研究的一个重要方向。水体会受到鱼类水产养殖、周围土地的作物种植和畜牧等农业活动的影响，从而产生水体的富营养化。近些年来，随着农业生产活动中农药和化肥的大量使用，造成了水体污染与富营养化，从而降低了微生物群落的生物多样性。在以往的研究中，已经揭示了农业生产活动中产生的环境污染对宏观生态群落的影响，而对微生物群落的微生态的研究还相对缺乏，特别是抗生素与微生态之间的研究。目前，一方面，在农业生产活动中产生的污染会改变水生生态系统的物理化学特性，这使得相关水体的微生物群落结构也会随之发生改变，尤其是水体中氮磷等元素的含量、水温及pH等理化因素，而这些因素对微生物群落的组成有很大影响。另一方面，在畜牧养殖业和水产养殖业这些农业生产活动中，抗生素已被广泛使用，这些抗生素可以用于防治疾病，加快动物生长和动物疾病的治疗。这些养殖活动产生的污水会随着地表径流流入水体中，从而引发水体的抗生素污染，继而改变水体中的微生物组成，并影响水体中物质的代谢。另外还可能会导致环境中细菌抗生素抗性的改变，产生抗生素的耐药性和超级细菌。此外，动物污水可能将动物体内细菌耐药性引入这些环境。但是，目前对于这些农业生产活动中产生的抗生素对水体环境微生物群落的影响的相关研究却很少。重要的是，关于农业生产活动对微生物群落影响的研究会为测定微生态系统对污染干扰的适应能力和制定环境保护的预防和修复措施提供保障，从而能够推进生态系统的保护与农业的可持续发展，进而维持生态环境与农业发展之间的平衡。因此，在本研究中，我们选择有着“湖北之肾”、“百湖之市”和“水乡泽国”之称的洪湖作为研究对象，通过收集水体和底泥的样本，进行高通量测序，解析它们的微生物群落结构，并测定样本的理化因素和抗生素含量，探讨洪湖农业生产活动对洪湖水体微生态的影响。
结果分析
研究人员从洪湖及其周边河流和池塘的18个采样位点共收集了14个水样和14个底泥样本。其中，位点L1是河流入口，而L3、L8、L9和L10的位置相对靠近水产养殖区域。同时，为了评估洪湖抗生素的主要来源，我们收集了与洪湖连接的四条主要河流内靠近洪湖的区域作为采样点（即R1至R4），以及四个与洪湖有水体交换的典型养殖池塘（即P1至P4）的样本。根据政府保护区的区域划分（空间位置）并考虑每个采样点不同的污染源（经处理的污水、作物、牲畜和鱼类养殖），将所有采样点分为两组，即受农业活动影响较大的组（impacted）和受农业活动影响较小的对照组（less-impacted）。其中，L1、L2、P1、P2、P3、P4、R1、R2、R3和R4采样点被分类为impacted组，而L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9和L10采样点被分类为less-impacted组（图1）。
图1 本研究中所有采样点的地理位置分布。
L，湖；P，池塘；R，河流。A.各种采样策略的定义。B.采样点位置的分布和每个采样点采集的样本类型。图中竖线阴影区和横线阴影区分别代表洪湖中受农业生产活动影响大的区域和影响小的区域。
对采集的水体和底泥样本进行16S rRNA基因扩增子测序。同时，一方面进行理化因素的测定，包括水温、pH、溶解氧、温度补偿电导率、盐度、氧化还原电位、浊度、叶绿素a、荧光溶解有机物、总磷、正磷酸盐、总氮、铵态氮、硝态氮、亚硝酸态氮和高锰酸钾指数等等；另一方面进行抗生素含量的测定，包括磺胺类抗生素中的磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、氨基磺酸盐、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑，氟喹诺酮类抗生素中的氟罗沙星、氧氟沙星、环丙沙星和二氟乙酸，以及四环素类中的四环素、土霉素和金霉素。在本研究中我们选择13种抗生素中的TC、OTC、CTC、SDZ、SMR、SMD、OFL、CIP和SMZ这9种抗生素用于下游分析。
对于微生物群落组成，我们在28个样本中共鉴定出53个门（图2A），并且水体和底泥样中微生物的群落结构有着显著性的差异（PERMANOVA，Bray-Curtis距离，P<0.01，图2B）。在水体中impacted和less-impacted组中，变形菌门、蓝藻门和芽孢菌门存在着显著性差异（t检验，P<0.05，图2C），而在底泥的两组样本中，则是放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门存在显著差异（t检验，P<0.05，图2D）。
图2 洪湖水样和底泥样本中微生物群落的分类组成及相对丰度。
在对样本间微生物群落结构的比较分析中，基于样本微生物群落组成计算得到的unweighted UniFrac的距离进行主坐标分析的可视化，结果显示洪湖水样和底泥样本可以明显的分为两大类（图3A），这表明水体和底泥样本的微生物群落结构存在显著性的差异。同时，水样和底泥样本中less-impacted和impacted样本之间也存在着明显的聚类情况，并且与水样相比，底泥样本中impacted组与less-impacted组的样本差异较大（图3B）。此外，基于unweighted UniFrac的距离的UPGMA树，也显示出水样和底泥样本impacted组与less-impacted组样本之间的微生物群落结构存在差异（图3C）。
图3 基于unweighted UniFrac距离对水样和底泥样本中的微生物群落进行聚类分析。
基于水样和底泥样本微生物群落组成，使用unweighted UniFrac距离对A.水样和底泥样本以及所有样本中B.impacted组和less-impacted组的PCoA分析。C.基于微生物群落样本组成，使用UPGMA的聚类方法对样本进行聚类。绿色和粉色字体分别代表less-impacted和impacted组。蓝条和红条分别表示水体和底泥样本。
基于所有样本微生物群落的功能组成，我们按照样本的类型和受农业生产活动影响的不同对微生物群落结构进行了比较分析。一方面，我们发现水体和底泥样本的功能组成存在显著性差异（PERMANOVA，Bray-Curtis距离，P<0.0001）。在水体的微生物群落中，肽酶、与氨基酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、DNA修复和重组以及精氨酸和脯氨酸代谢等功能的酶含量较高，而在底泥样本中功能主要富集在与核糖体合成、分泌系统、双组分系统、ABC转运和丙酮酸代谢等相关的通路上（图4）。另一方面，我们发现水样中impacted和less-impacted组的样本的微生物群落功能组成也存在着显著性的差异（PERMANOVA，Bray-Curtis距离，P<0.05），而底泥样本中的这两组之间却没有显著性差异。在水样微生物群落中，两组中涉及DNA修复和重组、嘌呤代谢、分泌系统、氧化磷酸化、嘧啶代谢、氨基酸相关酶以及精氨酸和脯氨酸代谢（t检验，P<0.05）的功能单元有显著性差异。
图4 洪湖水样和底泥样本中的微生物群落功能组成。
热图显示的是水样和底泥样本间微生物群落功能的组成。样本间UPGMA层次树是基于Spearman相关性进行构建的。图中群落功能组成单元的平均相对丰度超过0.01的。
在水样中，我们发现NH4+-N、TN、ORP、TP、Tur、CODMn和Chl-a等理化因子是影响impacted组样本微生物群落结构的重要因素，而在less-impacted组的样本中，微生物群落结构主要受pH和DO的影响（图5A）。在底泥样本，Sed-LP、Sed-TN和Sed-OM对less-impacted组的样本群落结构有着重要的影响，而Sed-TP则是影响impacted组样本的微生物群落结构的主要因素（图5B）。
在抗生素与微生物群落结构的分析中，我们发现土霉素（OTC）是影响水体微生物群落结构的重要因素之一（图5C），而在底泥样本中，磺胺甲嘧啶（SMR）则对impacted组中R1S、R2S、P1S、P3S和P4S的样本微生物群落结构有着重要的影响（图5D）。
图5 基于水体和底泥样本的微生物群落结构与理化因素和抗生素之间的典型对应分析。
理化因素与A.洪湖水样和B.底泥样本微生物群落结构的典型对应分析。抗生素数据与C.洪湖水样和D.底泥样本微生物群落结构的典型对应分析。***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05。
同样的，根据群落组成数据与理化因素之间的Mantel检验分析中，我们发现水体的TN、ORP、NO3--N和NO2--N等理化因子对微生物的群落结构有重要影响（图6A），而底泥中的Sed-OM和Sed-TN对底泥的微生物群落结构有重要影响（图6B）。类似的，在抗生素与群落组成的Mantel检验分析中，我们发现土霉素（OTC）与水样微生物群落的物种组成和功能组成密切相关（图6C），而四环素（TC）与底泥微生物群落的物种组成和功能组成密切相关（图6D）。
图6 洪湖水体和底泥样本中微生物群落组成的环境驱动因素。
理化因素中驱动A.水体和B.底泥样本微生物群落结构的理化因子。驱动C.水体和D.底泥样本的微生物群落结构的抗生素。在所有图中，三角矩阵中圆的大小和颜色代表两个因素之间的Pearson相关性，沿y轴的条形图中的颜色代表Pearson相关系数的值。线条的宽度代表距离相关的Mantel统计的r值，线条的颜色代表统计的显著性。
综上所述，我们可知理化因素和抗生素对水体和底泥的微生物群落结构有着重要的影响。在理化因子中TP和TN对微生物群落结构有着重要的影响，这个结果也是与已发表的文献是相一致的。在抗生素中，我们发现土霉素（OTC）与水样微生物群落的物种组成和功能组成密切相关，而四环素（TC）与底泥微生物群落的物种组成和功能组成密切相关。
为了表征农业生产活动所产生的农业污染对洪湖的影响，我们基于impacted和less-impacted组中样本的微生物组成，进行了生物标志物的分析（图7）。在水样中，我们共获得25个不同分类水平上的生物标志物，其中impacted组和less-impacted组分别为13个和12个。同样的，在底泥样本中，我们共发现19个不同分类水平的生物标志物。
图7 洪湖水样和底泥样本中impacted和less-impacted组的生物标志物分析。
A.水样中的生物标志物；B.水样生物标志物的系统发育结构枝状图；C.底泥样本中生物标志物；D.底泥生物标志物的系统发育结构枝状图。
此外，为了研究洪湖水体和底泥微生物群落成员之间的相互关系，我们分别构建了水体和底泥中微生物的共出现网络。从微生物之间的共出现网络的角度解析了微生物之间的关系以及农业生产活动之间的关系。
总结
1. 本研究证实了不仅水体和底泥样本的微生物群落结构存在显著性差异，而且水样和底泥中的impacted组和less-impacted组的微生物群落结构都存在着显著性差异，表明农业生产活动所产生污染的程度对微生物群落有着不同的影响。
2. 理化因素对微生物群落结构有着重要的影响，其中水体微生物群落结构主要是TN、TP、NO3--N和NO2--N等理化因素造成的，而在底泥样本中，则主要是受Sed-OM和Sed-TN的影响。
3. 抗生素对微生物群落结构也有着重要的影响，我们发现土霉素和四环素是造成水体和底泥微生物群落结构差异的主要因素。
4. 该研究揭示了农业活动中过渡使用的诸如化肥、除草剂和抗生素等化合物，会危害湖泊生态系统中微生物群落的生物多样性和群落结构，严重影响了水生生态系统中养分的循环和积累，继而影响整体农业生产力，也揭示了农业生产活动对湖泊生态系统所造成的影响，并提供了相关有用的生物标志物来反映这种影响，为我们进而对水体微生态进行监测和为生态系统的修复提供参考。
文章编译来源：Maozhen Han， Melissa Dsouza，Chunyu Zhou，Hongjun Li，Junqian Zhang，Chaoyun Chen，et al. Agricultural Risk Factors Influence Microbial Ecology in Honghu Lake. Genomics Proteomics Bioinformatics 2019,17(1). 引用请参考以上格式，英文全文详见https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1672022919300622。
Genomics， Proteomics & Bioinformatics（基因组蛋白质组与生物信息学报， 简称GPB）：创刊于2003年，是由中国科学院主管，中科院北京基因组所与中国遗传学会共同主办的英文版核心期刊。目前GPB为双月刊，由Elsevier以开放获取（Open Access）的模式出版，刊载来自世界范围内组学、生物信息学及相关领域的优质稿件。2017年被SCIE、JCR和CSTPCD数据库收录，连续六年获得“中国最具国际影响力学术期刊”称号（2013–2018），连续两期获得“中国科技期刊国际影响力提升计划”项目资助（2013–2018）。2018年，在基于Scopus数据库的CiteScore期刊影响力榜单中，位于“计算数学”、“遗传学”、“生物化学”、“分子生物学”四个学科领域Q1区；JCR报告公布的官方影响因子为6.615，位于“基因遗传学”学科领域Q1区；中科院期刊分区，位于“生物大类”学科领域Q1区。入选2018年“中国最美期刊”；获中科院出版基金科技期刊择优支持（2019）。
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